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摘要 [目的]了解江西遂川地区野生鹭科鸟类携带禽流感和新城疫病毒的感染情况。[方法] 于2014年10月在江西省遂川地区采集鹭科鸟类的肛拭子110份、咽拭子110份，采用SPF鸡胚进行病毒分离，通过血凝试验筛选出疑似阳性样品，然后再用RT-PCR进行鉴定。[结果] 在110份被检样品中，除4份样品外，其余样品的血凝效价均为0。经RT-PCR检测，所有样品禽流感和新城疫病毒检测结果均呈阴性。这表明2014年秋季江西遂川地区野生鹭科鸟类发生禽流感和新城疫病毒感染的风险较小。[结论] 该研究可为了解江西各地区野生水禽禽流感和新城疫的感染情况提供基础数据。
关键词 禽流感；新城疫；监测
中图分类号 S855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-129-02
Monitoring of Avian Influenza and Newcastle Disease Virus in Suichuan Region of Jiangxi Province
GENG Hai-dong1，2， JIN Hong-mei1， ZHANG Yan-jun3， ZHANG Guo-gang4*， CHAI Hong-liang1* et al
（1.College of Wildlife Resources， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. General Monitoring Station for Wildlife-borne Infectious Diseases，State Forestry Administration，Shenyang， Liaoning 110034； 3. Qinghuangdao Center for Wildlife Rescue and Protection， China Wildlife Conservation Association， Qinghuangdao， Hebei 066100； 4. National Bird Tagging Center， Research Institute of Forest Ecology， Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry， Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration， Beijing 100091）
Abstract [Objective] The research aimed to investigate the epidemiological characteristics of avian Influenza and newcastle disease virus of wild Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province. [Method] 110 oropharyngeal and 110 cloacal swabs of Ardeid birds were collected from Suichuan Region of Jiangxi Province in October of 2014. The viruses were separated by using SPF chicken embryos and suspected positive samples were screened out by hemagglutination test and identified by RT-PCR. [Result] Among 110 detected samples，hemagglutination titer of other samples was 0 except 4 samples. The detection results of RT-PCR showed that the detection samples of avian Influenza and newcastle disease virus of all samples were negative. This indicated that the infection risk of avian Influenza and newcastle disease of Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province in the summer of 2014 was small. [Conclusion] The research could provide basic data for understanding the infection situations of avian Influenza and newcastle disease of wild water birds in each region of Jiangxi Province.
Key words Avian influenza； Newcastle disease； Monitoring
新城疫（Newcastle disease，ND），也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以禽类消化道、呼吸道损伤为主要特征的一种急性、高度接触性、烈性传染病，常呈败血症经过。鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等多种家禽及野禽均易感染，人类也可以感染此病毒[1]。可以引起易感鸡群呼吸困难、甩头、流涎、神经紊乱、产蛋率下降等症状以及气管出血、腺胃乳头出血、肠道淋巴结组织有枣核状溃疡灶等病理变化[2-3]。该病流行于世界各國，给养禽业造成了巨大的经济损失，严重危害和威胁世界的养禽业，被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）列为 A 类疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前，新城疫已成为严重危害我国养鸡业的重要疾病之一，给养鸡业带来了严重损失。 禽流感（Avian influenza，AI）又称欧洲鸡瘟或者真性鸡瘟，是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的以感染禽类为主的高度接触性传染病，均属于A型流感病毒[4-5]。按照病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。其中，高致病性禽流感被国际兽医局（OIE）定性为A类烈性传染病，我国农业部也将其列为甲类监测传染病，而且被列入国际生物武器公约动物源传染病名单[6-7]。禽流感的每次爆发都带来了极其巨大的经济损失，严重危害了世界各国禽类养殖业的发展。据报道，2005年12月15日江西省遂川县曾发生H5N1亚型高致病性禽流感疫情。
江西遂川县泉江镇上溪村某农户饲养的鸭出现死亡，共死亡鸭1 640只，而这一疫情带来的相继扑杀工作给当地人造成了严重的经济损失。2013年12月江西省出现了人感染H10N8的病例。因此，对江西遂川地区野鸟携带和感染禽流感病毒和新城疫病毒的调查就显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
SPF鸡胚。SPF鸡胚，购自维科生物技术开发公司。
1.1.2
主要试剂。
Trizol，购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶，购自PROMEGA公司；Taq酶与dNTP，购自GenStar公司；RRI，购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1
样品来源。
在江西遂川地区主要采用活捕法（包括网捕法和笼捕法）捕捉到110只野生鹭科鸟类。每只鹭都采集咽拭子和肛拭子样品，样品共220份。置于拭子病毒保存液中-80 ℃保存备用。
1.2.2
病毒的分离。
采用鸡胚尿囊腔接种法进行病毒增殖。同一样品编号的处理后的咽拭子、肛拭子保存液上清各取0.1 ml，混合接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每个样品接种1枚SPF鸡胚，37 ℃全自动孵化器内孵育72 h，每隔12 h照胚观察1次。弃去24 h以内的死亡鸡胚，无菌环境下收获24～72 h内的死胚及活胚的尿囊液。所有样品经过鸡胚传代3次后，对收集的尿囊液进行血凝（HA）试验，测定血凝效价，并对HA阳性样品进行AIV和NDV的RT-PCR检测。
1.2.3
病毒RNA的提取。
①取200 μl HA阳性样品的尿囊夜于离心管中，加入600 μl裂解液，混合振荡90 s；②静置5 min后加入200 μl三氯甲烷，混匀振荡，静置2 min后12 000 r/min 4 ℃离心10 min；③取450 μl上清液于新的离心管中，加入450 μl异丙醇，混匀，室温沉降10 min，12 000 r/min 4 ℃下离心10 min；④弃上清，加入1 000 μl 75%酒精，12 000 r/min 4 ℃下离心10 min；⑤弃上清，干燥沉淀，加10 μl DEPC水进行溶解；⑥加2 μl反转录引物，70 ℃水浴5 min，冰上冷却5 min。⑦加入M-MLV反转录酶0.5 μl，RNA酶抑制剂05 μl，DEPC水3 μl，2.5 mmol/L的dNTP 4 μl和5×buffer 5 μl后进行反转录。⑧反转录后的核酸存放于-20 ℃条件下。
1.2.4
RT-PCR检测。
在PCR管中依次加入10×Buffer 2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，上、下游引物各1 μl（20 pmol/μl），Taq DNA聚合酶0.5 μl，反转录产物1.5 μl，补双蒸水至25 μl进行PCR（每个血凝阳性样品都要检测禽流感和新城疫病毒）。RT-PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、退火温度下30 s、72 ℃30 s，30个循环；最后，72 ℃延伸10 min。其中，AIV的退火温度为50 ℃，NDV的退火温度为531 ℃。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
2 结果与分析
2.1 血凝效价
对采集的尿囊液进行血凝试验。由表1可知，在110份被检样品中有4份有血凝试验结果呈阳性，其余血凝效价均为0。
2.2 RT-PCR检测结果
提取尿囊液中的病毒核酸为模板，使用自己设计的AIV鉴定引物和NDV鉴定引物分别进行PCR扩增。从图1～2可以看出，AIV阳性对照样品的目的片段大小为960 bp，NDV阳性对照样品的目的片段大小为375 bp。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，发现AIV阳性对照样品出现960 bp的目的片段，NDV阳性对照样品出现375 bp的目的片段，待检的血凝阳性样品未出现相应的目的片段。由此可见，待检的血凝样品的AIV和NDV检测结果均为阴性。
3 讨论
新城疫在世界范围内曾有过3次大流行。目前，该病在我国各地普遍存在，并且是我国养禽业危害最大、经济损失最严重的禽病之一[8] 。禽流感也是严重危害和威胁我国乃至全世界养禽业发展的A类疫病，每次暴发都会给养禽业带来巨大的经济损失。江西省遂川县被称为“遂川鸟道”，是全国三大候鸟迁徙通道之一，是我国华中地区迁徙鸟类的必经“隘口”，是迁徙鸟类往返俄罗斯、我国北方地区与东南亚，乃至澳大利亚和新西兰等路线上的关键点之一。候鸟在迁徙活动中，存在于候鸟体内的禽流感病毒或新城疫病毒将有可能在迁徙过程中进行传播。候鸟群中存在的呈低致病性的禽流感病毒有可能通过家禽与野生鸟类接触，传染给家禽，在家禽中重组和变异，导致高致病性禽流感（ HPAI）病毒的產生。自1959 年以来，在世界范围内这种由野生鸟类中的
LPAI 传染给家禽，在家禽中变异成为HPAI，最终导致疫情的多次暴发[9]。由此可见，对这个地区禽流感和新城疫病毒的监测将有利于预测与此通道相关地区疫情的暴发情况。 笔者对江西省遂川地区野生鹭科鸟类进行了样品采集，对这批样品禽流感和新城疫病毒的鉴定结果均为阴性。这可能有以下原因：①在采集样品后未能及时放入-80 ℃冰箱内保存，在运回实验室过程中可能温度过高造成了病毒的损失。②可能是因为采集样品過少，病毒量太低而未能检测出来。虽然通过该试验将不能充分了解江西各地区野生水禽感染禽流感和新城疫流行情况，但可为今后进一步研究提供有价值的信息和基础数据。
参考文献
[1] 吴建华，秦卓明，孙梅，等. 一株新城疫强毒株的分离鉴定[J].动物医学进展，2005，26（12）：111-113.
[2] 蔡宝祥. 家畜传染病学[M].4版.北京：中国农业出版社，2006：304-309.
[3] B·M·卜尔尼克. 禽病学[M].10版.北京：中国农业出版社，1997：691-792.
[4] JAHANGIR A，RUENPHET S，SHOHAM D，et al.Phenotypic，genetic，and phylogeographical characterization of avian influenza virus subtype H5N2 isolated from northern pintail（Anas acuta）in Japan[J].Virus research，2009，145（2）：329-333.
[5] CHAHARAEIN B.Detection of H5，H7 and H9 subtypes of avianinfluenza viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction[J].Microbiological research，2009，164：174-179.
[6] B·W·卡尔尼克.禽病学[M].9版.北京：北京农业大学出版社，1991.
[7] 甘孟侯.全球禽流感的流行形势[J].中国预防兽医学报，2004，26（6）：468-471.
[8] 由轩，谢晓峰，杨鹏飞.中俄边境地区野生候鸟禽流感的流行病学调查[J].黑龙江畜牧兽医，2011（11）：117-118.
[9] 崔治中.我国新城疫流行现状[J].中国家禽，2002，24（4）：4-6.
责任编辑 宋平 责任校对 李岩
关键词 禽流感；新城疫；监测
中图分类号 S855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）27-129-02
Monitoring of Avian Influenza and Newcastle Disease Virus in Suichuan Region of Jiangxi Province
GENG Hai-dong1，2， JIN Hong-mei1， ZHANG Yan-jun3， ZHANG Guo-gang4*， CHAI Hong-liang1* et al
（1.College of Wildlife Resources， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. General Monitoring Station for Wildlife-borne Infectious Diseases，State Forestry Administration，Shenyang， Liaoning 110034； 3. Qinghuangdao Center for Wildlife Rescue and Protection， China Wildlife Conservation Association， Qinghuangdao， Hebei 066100； 4. National Bird Tagging Center， Research Institute of Forest Ecology， Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry， Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration， Beijing 100091）
Abstract [Objective] The research aimed to investigate the epidemiological characteristics of avian Influenza and newcastle disease virus of wild Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province. [Method] 110 oropharyngeal and 110 cloacal swabs of Ardeid birds were collected from Suichuan Region of Jiangxi Province in October of 2014. The viruses were separated by using SPF chicken embryos and suspected positive samples were screened out by hemagglutination test and identified by RT-PCR. [Result] Among 110 detected samples，hemagglutination titer of other samples was 0 except 4 samples. The detection results of RT-PCR showed that the detection samples of avian Influenza and newcastle disease virus of all samples were negative. This indicated that the infection risk of avian Influenza and newcastle disease of Ardeid birds in Suichuan Region of Jiangxi Province in the summer of 2014 was small. [Conclusion] The research could provide basic data for understanding the infection situations of avian Influenza and newcastle disease of wild water birds in each region of Jiangxi Province.
Key words Avian influenza； Newcastle disease； Monitoring
新城疫（Newcastle disease，ND），也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的以禽类消化道、呼吸道损伤为主要特征的一种急性、高度接触性、烈性传染病，常呈败血症经过。鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等多种家禽及野禽均易感染，人类也可以感染此病毒[1]。可以引起易感鸡群呼吸困难、甩头、流涎、神经紊乱、产蛋率下降等症状以及气管出血、腺胃乳头出血、肠道淋巴结组织有枣核状溃疡灶等病理变化[2-3]。该病流行于世界各國，给养禽业造成了巨大的经济损失，严重危害和威胁世界的养禽业，被世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）列为 A 类疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前，新城疫已成为严重危害我国养鸡业的重要疾病之一，给养鸡业带来了严重损失。 禽流感（Avian influenza，AI）又称欧洲鸡瘟或者真性鸡瘟，是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的以感染禽类为主的高度接触性传染病，均属于A型流感病毒[4-5]。按照病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。其中，高致病性禽流感被国际兽医局（OIE）定性为A类烈性传染病，我国农业部也将其列为甲类监测传染病，而且被列入国际生物武器公约动物源传染病名单[6-7]。禽流感的每次爆发都带来了极其巨大的经济损失，严重危害了世界各国禽类养殖业的发展。据报道，2005年12月15日江西省遂川县曾发生H5N1亚型高致病性禽流感疫情。
江西遂川县泉江镇上溪村某农户饲养的鸭出现死亡，共死亡鸭1 640只，而这一疫情带来的相继扑杀工作给当地人造成了严重的经济损失。2013年12月江西省出现了人感染H10N8的病例。因此，对江西遂川地区野鸟携带和感染禽流感病毒和新城疫病毒的调查就显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
SPF鸡胚。SPF鸡胚，购自维科生物技术开发公司。
1.1.2
主要试剂。
Trizol，购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶，购自PROMEGA公司；Taq酶与dNTP，购自GenStar公司；RRI，购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1
样品来源。
在江西遂川地区主要采用活捕法（包括网捕法和笼捕法）捕捉到110只野生鹭科鸟类。每只鹭都采集咽拭子和肛拭子样品，样品共220份。置于拭子病毒保存液中-80 ℃保存备用。
1.2.2
病毒的分离。
采用鸡胚尿囊腔接种法进行病毒增殖。同一样品编号的处理后的咽拭子、肛拭子保存液上清各取0.1 ml，混合接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，每个样品接种1枚SPF鸡胚，37 ℃全自动孵化器内孵育72 h，每隔12 h照胚观察1次。弃去24 h以内的死亡鸡胚，无菌环境下收获24～72 h内的死胚及活胚的尿囊液。所有样品经过鸡胚传代3次后，对收集的尿囊液进行血凝（HA）试验，测定血凝效价，并对HA阳性样品进行AIV和NDV的RT-PCR检测。
1.2.3
病毒RNA的提取。
①取200 μl HA阳性样品的尿囊夜于离心管中，加入600 μl裂解液，混合振荡90 s；②静置5 min后加入200 μl三氯甲烷，混匀振荡，静置2 min后12 000 r/min 4 ℃离心10 min；③取450 μl上清液于新的离心管中，加入450 μl异丙醇，混匀，室温沉降10 min，12 000 r/min 4 ℃下离心10 min；④弃上清，加入1 000 μl 75%酒精，12 000 r/min 4 ℃下离心10 min；⑤弃上清，干燥沉淀，加10 μl DEPC水进行溶解；⑥加2 μl反转录引物，70 ℃水浴5 min，冰上冷却5 min。⑦加入M-MLV反转录酶0.5 μl，RNA酶抑制剂05 μl，DEPC水3 μl，2.5 mmol/L的dNTP 4 μl和5×buffer 5 μl后进行反转录。⑧反转录后的核酸存放于-20 ℃条件下。
1.2.4
RT-PCR检测。
在PCR管中依次加入10×Buffer 2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，上、下游引物各1 μl（20 pmol/μl），Taq DNA聚合酶0.5 μl，反转录产物1.5 μl，补双蒸水至25 μl进行PCR（每个血凝阳性样品都要检测禽流感和新城疫病毒）。RT-PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、退火温度下30 s、72 ℃30 s，30个循环；最后，72 ℃延伸10 min。其中，AIV的退火温度为50 ℃，NDV的退火温度为531 ℃。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
2 结果与分析
2.1 血凝效价
对采集的尿囊液进行血凝试验。由表1可知，在110份被检样品中有4份有血凝试验结果呈阳性，其余血凝效价均为0。
2.2 RT-PCR检测结果
提取尿囊液中的病毒核酸为模板，使用自己设计的AIV鉴定引物和NDV鉴定引物分别进行PCR扩增。从图1～2可以看出，AIV阳性对照样品的目的片段大小为960 bp，NDV阳性对照样品的目的片段大小为375 bp。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，发现AIV阳性对照样品出现960 bp的目的片段，NDV阳性对照样品出现375 bp的目的片段，待检的血凝阳性样品未出现相应的目的片段。由此可见，待检的血凝样品的AIV和NDV检测结果均为阴性。
3 讨论
新城疫在世界范围内曾有过3次大流行。目前，该病在我国各地普遍存在，并且是我国养禽业危害最大、经济损失最严重的禽病之一[8] 。禽流感也是严重危害和威胁我国乃至全世界养禽业发展的A类疫病，每次暴发都会给养禽业带来巨大的经济损失。江西省遂川县被称为“遂川鸟道”，是全国三大候鸟迁徙通道之一，是我国华中地区迁徙鸟类的必经“隘口”，是迁徙鸟类往返俄罗斯、我国北方地区与东南亚，乃至澳大利亚和新西兰等路线上的关键点之一。候鸟在迁徙活动中，存在于候鸟体内的禽流感病毒或新城疫病毒将有可能在迁徙过程中进行传播。候鸟群中存在的呈低致病性的禽流感病毒有可能通过家禽与野生鸟类接触，传染给家禽，在家禽中重组和变异，导致高致病性禽流感（ HPAI）病毒的產生。自1959 年以来，在世界范围内这种由野生鸟类中的
LPAI 传染给家禽，在家禽中变异成为HPAI，最终导致疫情的多次暴发[9]。由此可见，对这个地区禽流感和新城疫病毒的监测将有利于预测与此通道相关地区疫情的暴发情况。 笔者对江西省遂川地区野生鹭科鸟类进行了样品采集，对这批样品禽流感和新城疫病毒的鉴定结果均为阴性。这可能有以下原因：①在采集样品后未能及时放入-80 ℃冰箱内保存，在运回实验室过程中可能温度过高造成了病毒的损失。②可能是因为采集样品過少，病毒量太低而未能检测出来。虽然通过该试验将不能充分了解江西各地区野生水禽感染禽流感和新城疫流行情况，但可为今后进一步研究提供有价值的信息和基础数据。
参考文献
[1] 吴建华，秦卓明，孙梅，等. 一株新城疫强毒株的分离鉴定[J].动物医学进展，2005，26（12）：111-113.
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[3] B·M·卜尔尼克. 禽病学[M].10版.北京：中国农业出版社，1997：691-792.
[4] JAHANGIR A，RUENPHET S，SHOHAM D，et al.Phenotypic，genetic，and phylogeographical characterization of avian influenza virus subtype H5N2 isolated from northern pintail（Anas acuta）in Japan[J].Virus research，2009，145（2）：329-333.
[5] CHAHARAEIN B.Detection of H5，H7 and H9 subtypes of avianinfluenza viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction[J].Microbiological research，2009，164：174-179.
[6] B·W·卡尔尼克.禽病学[M].9版.北京：北京农业大学出版社，1991.
[7] 甘孟侯.全球禽流感的流行形势[J].中国预防兽医学报，2004，26（6）：468-471.
[8] 由轩，谢晓峰，杨鹏飞.中俄边境地区野生候鸟禽流感的流行病学调查[J].黑龙江畜牧兽医，2011（11）：117-118.
[9] 崔治中.我国新城疫流行现状[J].中国家禽，2002，24（4）：4-6.
责任编辑 宋平 责任校对 李岩