论文部分内容阅读
【摘 要】目的：建立巴豆油部分的高效液相色谱指纹图谱，为科学评价与有效控制巴豆油质量提供新方法和依据。方法：采用HPLC-ELSD法，测定10批巴豆样品。结果：在色谱指纹图谱中，确立了其中14个共有峰，建立了巴豆油部分的共有模式，10批样品指纹图谱相似度在0.758～0.998之间。结论：该方法简便、准确、重现性好，为评价巴豆油的定性鉴别及内在质量提供了科学依据。
【关键词】巴豆油；亚油酸；HPLC-ELSD；指纹图谱
【中图分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0030—02
巴豆油来源于中药材巴豆（大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果实）。巴豆主产于西南及福建、湖北、湖南、广东、广西等地[1]。性辛，热；有大毒，归胃、大肠经。内服泻下寒积，逐水消肿，祛痰利咽，外用蚀疮，可用于恶疮疥癣[2]。因其毒性较大，多制成霜剂使用。巴豆中的脂肪油是其主要活性成分，同时也是其有毒成分。目前，有文献报道可以用气相色谱-质谱联用仪法测定巴豆中脂肪酸的含量测定以及指纹图谱的研究[3，4]，但气相色谱法-质谱联用仪只能测到脂肪油中的游离型脂肪酸，该方法具有很大的局限性。除此之外，有文献报道有关巴豆非脂肪油部分HPLC指纹图谱研究[5]，但尚未見有文献报道有关巴豆油的指纹图谱研究，同时鉴于巴豆潜在的重要价值，对其进行指纹图谱研究具有重大意义[6]。
1 实验材料
1.1仪器：Shimadzu高效液相色谱仪（配SIL-20A自动进样器， SPD-20A二极管阵列检测器，CTO-20A柱温箱，Shimadzu LC Solution色谱工作站，日本Shimadzu公司），Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），METTLER TOLEDO AB204-N电子分析天平，SEDEX75蒸发光散射检测器，ULTRASONIC CLEANER超声仪。
1.2试药： 10批巴豆药材分别购自四川、广西、云南等三个主产区，所购药材经广州中医药大学新药开发研究中心赖小平研究员鉴定为大戟科植物巴豆的成熟果实，结果见表1。亚油酸（中国药品生物制品检定所，批号为116222-200301，纯度>98%），供含量测定用。异丙醇为色谱纯、乙腈为色谱纯，高纯氮（广州福北协力气体有限公司），其他试剂为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈：异丙醇（53：47）等度洗脱；流速0.8mL·min-1；蒸发光散射检测器；柱温25℃；进样量10μL；记录时间60min；进样量10μL。理论塔板数以亚油酸峰计算，应不低于3000。
2.2巴豆油的制备：取购于不同的产地共10批干燥的巴豆种子，去壳后将种仁粉碎，取约50g，精密称定，用滤纸包裹，置索氏提取器中，加适量乙醚，40℃水浴加热，提取8h，蒸干乙醚提取液，放冷，得巴豆油（浅黄色油状，相对密度为0.90g·mL-1），备用。
2.3 供试品溶液制备：精密称取200mg左右的巴豆油置于10mL容量瓶中，加流动相乙腈：异丙醇（53：47）溶解，超声使其溶解完全，然后稀释至刻度，取适量溶液，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 参照物溶液的制备：精密称取亚油酸对照品适量，加乙腈：异丙醇（53：47）溶解制成0.525 g·mL-1的参照物溶液。以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验：取10号供试品1份， 按2.2项下样品制备方法制备后，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，表明精密度良好，符合对指纹图谱的要求。
2.5.2 稳定性试验：取10号供试品1份，按2.2项下样品制备方法制备后，按2.1项下色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10，12，24h进样，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，表明24h内供试品溶液的成分稳定，符合对指纹图谱的要求。
2.5.3 重复性试验：精密量取10号供试品6份，每份2mL，按照2.2项下样品制备方法制备，平行制得6份供试品溶液。按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，表明实验重复性良好，符合对指纹图谱的要求。
2.6 样品测定： 取10批巴豆供试品，按2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下依次进样检测，记录色谱图， 对照品溶液HPLC-ELSD色谱图，见图1。10批巴豆供试品的HPLC-ELSD色谱叠加图，见图2。
图 1 亚油酸对照品HPLC-ELSD色谱图
图2 10批巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱；R为共有模式
2.7 指纹图谱的建立
2.7.1 参照峰的选择： 将亚油酸对照品色谱图与样品色谱图中保留时间相同的色谱峰进行比较，其紫外吸收光谱完全一致，故可以确定样品色谱图中S号特征峰为亚油酸。在各批次样品图谱中亚油酸的色谱峰分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定亚油酸为参照峰。
2.7.2不同来源的药材指纹图谱及相似度评价： 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（研究版）软件，以批号为BD20100420巴豆油的图谱作为参照谱进行指纹匹配，确定了14个共有峰，建立了巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱的共有模式，进行了相似度计算， 用平均数表示10批样品的相似度见表3。14个共有峰的面积总和占总面积的比例大于90%。以亚油酸为参照物（S号峰），其保留时间和峰面积为l，计算其它各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4和表5。 3 讨论
3.1 色谱条件的选择： 本实验通过对流动相乙腈-异丙醇（1：1）、乙腈-异丙醇（51：49）、乙腈-异丙醇（53：47）、乙腈-异丙醇梯度洗脱四个不同的比例考察，结果表明乙腈-异丙醇（53：47）等度洗脱，各色谱峰的保留时间较为适中，分离度良好，对称性较佳，且基线平稳，方便作为指纹图谱的分析，故选择乙腈-异丙醇（53：47）作为流动相系统。
3.2 色谱柱的选择： 实验中考察了不同品牌：Thermo Hypersil Gold C18、Kromasil C18、Agilent Eclipse XDB C18的三根十八烷基键和相硅胶色谱柱，结果表明，相比其他两根色谱柱，采用Agilent Eclipse XDB C18色谱柱时基线平稳，色谱峰数目较多，分离度和峰形极佳，因此，该色谱柱进行指纹图谱研究。
3.3 本实验建立了巴豆油的HPLC-SELSD指纹图谱：巴豆作为毒性极强的一种常见中药材，其脂肪油部位的成分很复杂。目前，国内外对巴豆油中化学成分的研究还不够深入、成熟，而且巴豆脂肪油具有极强的药理活性，有待进一步研究、开发。2010版的《中国药典》中只是对巴豆脂肪油的含量做了一个粗糙的限定，而这对于全面反映该药材的质量，指导临床上安全、合理用药来说，是远远不够的。因此，建立全面、系统而又特征地反映巴豆油部分化学成分的指纹图谱，可以为巴豆油及其巴豆药材的质量评价和控制提供有效的参考和依据，具有重大意义[7]。
通过建立巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱，确立了14个共有峰，并指认了其中1个色谱峰。 对十批巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱进行相似度评价，表明指纹图谱共有峰相对保留时间基本一致，共有峰相对峰面积差异较大，提示不同来源的巴豆药材化学成分种类相似，但含量差异较大。实验证明该方法操作性强，重复性好， 具有较强的特征性和代表性，可为巴豆油的内在质量控制提供科学的依据。
参考文献：
[1] 南京中医药大学，中藥大辞典（第2版）.上册[M].上海：上海科学技术出版社，2006：702.
[2] 中国药典.一部[S].2010：74.
[3] 胡静，高文远，凌宁生等.巴豆和巴豆霜挥发性成分的GC-MS分析[J].中国中药志，2008，33（4）：464-465.
[4] 梁英，潘英明.巴豆种子油的GC-MS分析[J].光谱实验室，2002，19（6）：748-750.
[5] 黄孟秋，曾宝，李生梅.巴豆非脂肪油部分HPLC指纹图谱研究[J].中药新药与临床理，2011，22（4）：444-447.
[6] 谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理，2001，12（3）：141.
[7] 谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京：人民卫生出版社，2005：125.
【关键词】巴豆油；亚油酸；HPLC-ELSD；指纹图谱
【中图分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0030—02
巴豆油来源于中药材巴豆（大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果实）。巴豆主产于西南及福建、湖北、湖南、广东、广西等地[1]。性辛，热；有大毒，归胃、大肠经。内服泻下寒积，逐水消肿，祛痰利咽，外用蚀疮，可用于恶疮疥癣[2]。因其毒性较大，多制成霜剂使用。巴豆中的脂肪油是其主要活性成分，同时也是其有毒成分。目前，有文献报道可以用气相色谱-质谱联用仪法测定巴豆中脂肪酸的含量测定以及指纹图谱的研究[3，4]，但气相色谱法-质谱联用仪只能测到脂肪油中的游离型脂肪酸，该方法具有很大的局限性。除此之外，有文献报道有关巴豆非脂肪油部分HPLC指纹图谱研究[5]，但尚未見有文献报道有关巴豆油的指纹图谱研究，同时鉴于巴豆潜在的重要价值，对其进行指纹图谱研究具有重大意义[6]。
1 实验材料
1.1仪器：Shimadzu高效液相色谱仪（配SIL-20A自动进样器， SPD-20A二极管阵列检测器，CTO-20A柱温箱，Shimadzu LC Solution色谱工作站，日本Shimadzu公司），Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），METTLER TOLEDO AB204-N电子分析天平，SEDEX75蒸发光散射检测器，ULTRASONIC CLEANER超声仪。
1.2试药： 10批巴豆药材分别购自四川、广西、云南等三个主产区，所购药材经广州中医药大学新药开发研究中心赖小平研究员鉴定为大戟科植物巴豆的成熟果实，结果见表1。亚油酸（中国药品生物制品检定所，批号为116222-200301，纯度>98%），供含量测定用。异丙醇为色谱纯、乙腈为色谱纯，高纯氮（广州福北协力气体有限公司），其他试剂为分析纯，水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈：异丙醇（53：47）等度洗脱；流速0.8mL·min-1；蒸发光散射检测器；柱温25℃；进样量10μL；记录时间60min；进样量10μL。理论塔板数以亚油酸峰计算，应不低于3000。
2.2巴豆油的制备：取购于不同的产地共10批干燥的巴豆种子，去壳后将种仁粉碎，取约50g，精密称定，用滤纸包裹，置索氏提取器中，加适量乙醚，40℃水浴加热，提取8h，蒸干乙醚提取液，放冷，得巴豆油（浅黄色油状，相对密度为0.90g·mL-1），备用。
2.3 供试品溶液制备：精密称取200mg左右的巴豆油置于10mL容量瓶中，加流动相乙腈：异丙醇（53：47）溶解，超声使其溶解完全，然后稀释至刻度，取适量溶液，以0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4 参照物溶液的制备：精密称取亚油酸对照品适量，加乙腈：异丙醇（53：47）溶解制成0.525 g·mL-1的参照物溶液。以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验：取10号供试品1份， 按2.2项下样品制备方法制备后，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，表明精密度良好，符合对指纹图谱的要求。
2.5.2 稳定性试验：取10号供试品1份，按2.2项下样品制备方法制备后，按2.1项下色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10，12，24h进样，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，表明24h内供试品溶液的成分稳定，符合对指纹图谱的要求。
2.5.3 重复性试验：精密量取10号供试品6份，每份2mL，按照2.2项下样品制备方法制备，平行制得6份供试品溶液。按2.1项下色谱条件进样，记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3%，表明实验重复性良好，符合对指纹图谱的要求。
2.6 样品测定： 取10批巴豆供试品，按2.2项下方法制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下依次进样检测，记录色谱图， 对照品溶液HPLC-ELSD色谱图，见图1。10批巴豆供试品的HPLC-ELSD色谱叠加图，见图2。
图 1 亚油酸对照品HPLC-ELSD色谱图
图2 10批巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱；R为共有模式
2.7 指纹图谱的建立
2.7.1 参照峰的选择： 将亚油酸对照品色谱图与样品色谱图中保留时间相同的色谱峰进行比较，其紫外吸收光谱完全一致，故可以确定样品色谱图中S号特征峰为亚油酸。在各批次样品图谱中亚油酸的色谱峰分离良好，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定亚油酸为参照峰。
2.7.2不同来源的药材指纹图谱及相似度评价： 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》（研究版）软件，以批号为BD20100420巴豆油的图谱作为参照谱进行指纹匹配，确定了14个共有峰，建立了巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱的共有模式，进行了相似度计算， 用平均数表示10批样品的相似度见表3。14个共有峰的面积总和占总面积的比例大于90%。以亚油酸为参照物（S号峰），其保留时间和峰面积为l，计算其它各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4和表5。 3 讨论
3.1 色谱条件的选择： 本实验通过对流动相乙腈-异丙醇（1：1）、乙腈-异丙醇（51：49）、乙腈-异丙醇（53：47）、乙腈-异丙醇梯度洗脱四个不同的比例考察，结果表明乙腈-异丙醇（53：47）等度洗脱，各色谱峰的保留时间较为适中，分离度良好，对称性较佳，且基线平稳，方便作为指纹图谱的分析，故选择乙腈-异丙醇（53：47）作为流动相系统。
3.2 色谱柱的选择： 实验中考察了不同品牌：Thermo Hypersil Gold C18、Kromasil C18、Agilent Eclipse XDB C18的三根十八烷基键和相硅胶色谱柱，结果表明，相比其他两根色谱柱，采用Agilent Eclipse XDB C18色谱柱时基线平稳，色谱峰数目较多，分离度和峰形极佳，因此，该色谱柱进行指纹图谱研究。
3.3 本实验建立了巴豆油的HPLC-SELSD指纹图谱：巴豆作为毒性极强的一种常见中药材，其脂肪油部位的成分很复杂。目前，国内外对巴豆油中化学成分的研究还不够深入、成熟，而且巴豆脂肪油具有极强的药理活性，有待进一步研究、开发。2010版的《中国药典》中只是对巴豆脂肪油的含量做了一个粗糙的限定，而这对于全面反映该药材的质量，指导临床上安全、合理用药来说，是远远不够的。因此，建立全面、系统而又特征地反映巴豆油部分化学成分的指纹图谱，可以为巴豆油及其巴豆药材的质量评价和控制提供有效的参考和依据，具有重大意义[7]。
通过建立巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱，确立了14个共有峰，并指认了其中1个色谱峰。 对十批巴豆油的HPLC-ELSD指纹图谱进行相似度评价，表明指纹图谱共有峰相对保留时间基本一致，共有峰相对峰面积差异较大，提示不同来源的巴豆药材化学成分种类相似，但含量差异较大。实验证明该方法操作性强，重复性好， 具有较强的特征性和代表性，可为巴豆油的内在质量控制提供科学的依据。
参考文献：
[1] 南京中医药大学，中藥大辞典（第2版）.上册[M].上海：上海科学技术出版社，2006：702.
[2] 中国药典.一部[S].2010：74.
[3] 胡静，高文远，凌宁生等.巴豆和巴豆霜挥发性成分的GC-MS分析[J].中国中药志，2008，33（4）：464-465.
[4] 梁英，潘英明.巴豆种子油的GC-MS分析[J].光谱实验室，2002，19（6）：748-750.
[5] 黄孟秋，曾宝，李生梅.巴豆非脂肪油部分HPLC指纹图谱研究[J].中药新药与临床理，2011，22（4）：444-447.
[6] 谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理，2001，12（3）：141.
[7] 谢培山.中药色谱指纹图谱[M].北京：人民卫生出版社，2005：125.