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【摘 要】目的：制备柞蚕丝素蛋白/羟基磷灰石复合支架，改善单纯羟基磷灰石（HA）支架材料的生物学特性。方法：将羟基磷灰石多孔支架材料浸泡在柞蚕丝素蛋白的水溶液中，抽真空处理48h，采取冷冻干燥法制备的方法，进行羟基磷灰石支架表面修饰。实验分为HA 支架组（单纯羟基磷灰石支架组） 与（TSF/HA）柞蚕丝素蛋白/羟基磷灰石支架组。按ISO 10993 标准，两组分别做体外降解实验、吸水测试及细胞粘附实验。结果：SEM镜下观察TSF/HA支架孔隙内壁上细胞粘附高于单纯HA支架，吸水率实验检测TSF-HA支架组吸水率高于单纯HA支架组，体外降解实验TSF/HA支架降解速率快于单纯HA支架，各项检测差异均有统计学意义（P<0.05）。结论： TSF/HA支架材料具有比单纯HA支架材料更优良的生物学特性， 可以用于后续的实验研究。
【关键词】柞蚕丝素蛋白；羟基磷灰石；生物学特性
【中图分类号】R318 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0015—02
引言
各种创伤、肿瘤、感染等诸多原因导致骨缺损的病例不断增加，临床医生面临着巨大挑战。作为治疗骨缺损的“金标准”自体骨移植和“标准方法”[1-2]的同种异体骨移植，因其缺点如自体骨移植的骨来源有限、量不足、副损伤大、供区感染等；同种异体骨移植可传播疾病、免疫排斥反应、伦理等问题，导致两种骨移植方法受到限制。人们开始致力于骨替代材料的研究，我国自从上世纪80年代四川大学和武汉工业大学等根据人体骨无机成分的主要成分羟基磷灰石（HA），先后研制出了HA支架材料， 作为人体硬组织修复和替代组织工程材料，并很快的应用于临床。但因HA质脆、吸收性差、不易降解等临床使用受到限制。丝素蛋白具有独特机械特性和生物相容性，类似骨组织中的胶原，具有胶原的一些特性。柞蚕丝蛋白不但具有家蚕丝素蛋白的特性，而且还含有大量的 Arg-Gly-Asp（精氨酸-乙氨酸-天门冬氨酸，RGD）三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进支架对细胞的黏附。
本文采用冷冻干燥技术完成柞蚕丝蛋白对HA三维支架材料的修饰，通过体外降解实验、吸水测试及细胞粘附实验等观察，寻求一种理想的骨支架材料。
1 材料与方法
1.1 实验动物
由辽宁医学院动物实验中心提供出生24h内的乳兔1只。
1.2 实验方法
1.2.1 柞蚕丝蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备：将羟基磷灰石多孔支架材料浸泡在浓度为12 g/L的柞蚕丝素蛋白水溶液中（本课题组制备测定保存），抽真空处理48h，然后移入-80℃冰箱冻结后，放入冷冻干燥仪进行冷冻干燥30 h。
1.2.2 兔骨髓间充质干细胞的复苏培养：取本室冻存的兔BMSCs，取出后立即置于的水浴箱中快速复温至保存液完全融化， 1000r/min离心10分钟，吸弃上清液，加入2ml完全培养液吹打管反复吹打底部细胞，重复离心一次，重悬细胞，按1×106/ml的密度接种于培养瓶中，置于37℃，50ml/L CO2饱和湿度条件下的培养箱进行培养，48h后换液，以后每隔2-3d换液一次。待细胞达80%融合后，0.25%胰酶消化，1：3传代。
1.2.3 细胞黏附实验：用0.25%胰蛋白酶消化分离对数生长期的细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/ml。将100μl细胞悬液种植到孔中覆盖有两种材料（直径13mm，厚1mm）的24孔细胞培养板，将细胞培养板置于培养箱中培养，分别培养5d、7d、9d后PBS轻轻洗3次以除去未贴壁的细胞，然后每孔加入0.5ml 0.25%胰蛋白酶消化各组材料上的细胞，轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，在倒置显微镜下用血细胞计数板计数黏附于材料的细胞数，细胞黏附率计算公式如下：黏附率（%）=材料表面的黏附数/接种到材料表面总数×100%。
1.2.4扫描电镜观察支架的形态、孔径大小及细胞黏附生长情况：切取约2 mm厚的支架横截面，放光镜下观察支架的孔隙及孔径大小；切取支架样本，用导电双面胶粘在金属托架上，喷铂金后在扫描电镜下观察支架的结构。
1.2.5 支架吸水率测试：分别称取5枚TSF/HA复合支架和HA支架，称取原始支架重量，然后将其置于有蒸馏水的小烧杯中，分别浸泡0.5、2、6、12及24h，各时间点取出支架，用滤纸轻轻吸去表面多余水分，用电子天平称得吸水后的重量，取其均值。吸水率计算公式：吸水率=[（现重-初重）/现重]×100%。
1.2.6降解性测试：将支架材料切割成圆柱状（直径20.0mm，厚度5mm）备用。在50ml离心管中注入30mlPBS缓冲液（ pH 7.4 ），将已知重量的圆柱状支架材料放入离心管后密封，放置于37℃的恒温培养箱中。每隔2周取出支架蒸馏水冲洗，去除表面水分，冷冻干燥后称重，并测定离心管内降解液的pH值，半量更换PBS缓冲液。8周后取出样品，并計算降解率[3]。降解率=[（初重-现重）/初重]×100% 每次均做3个平行实验试样，取其平均值。
1.2.7 统计学分析：数据用 表示，数据处理应用SPSS 13.0统计软件包。采用析因分析及q检验两两比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SEM观察
TSF/HA材料孔隙壁粗糙，较多丝素蛋白颗粒；HA材料孔隙壁光滑。与BMSCs复合后，第三天见有微绒毛突起的细胞，细胞出现拉丝状物质，第七天时细胞几乎全部连接，分泌大量网状胶原。
2.2 TSF/HA与HA细胞粘附性
分别在5、7、9天后进行两种材料细胞粘附实验，对比图如下： 图1 细胞粘附对比图
复合支架在细胞接种5天时即表现出了良好的吸附性，同一时间点两组材料差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 TSF/HA与HA吸水率比较
同一时间点两种支架吸水性可以看出TSF/HA组高于HA组，其差异有统计学意义P <0.01，见表1。
2.4 TSF/HA与HA降解率比较
两种支架在体外降解过程中，其降解液的pH值基本稳定，8周结束时SF/HA支架降解液的pH值为6.78，HA支架降解液的pH值为6.82，基本保持了生理PH值，说明以上两种支架在降解过程中不会产生过酸、过碱有害物质。SF/HA支架的重量由8周前的1.08g降至现在的0.67g，HA支架由当初的1.07g降至现在的0.84g，根据公式得出SF/HA支架的降解率为38.06%，单纯支架的降解率为21.02%。TSF/HA支架的降解率明显好于HA支架的降解率，见图2：
图 2 SF/HA与HA降解对比图
3 讨论
随着组织工程学的发展，采用组织工程方法构建骨复合组织来了修复骨缺损进行不断的研究。在已往的研究中发现，HA是一种具有优良的生物相容性和生物活性的支架材料，但因其多孔陶瓷脆性大、韧性不足、力学性能差和不可降解的缺点，须通过不同的方法改善其性能。柞蚕丝素蛋白是从野生蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，它具有普通蚕丝蛋白的特点[4]： ①有独特的力学特性；②良好的吸湿性、透气性。可通过不同方法获得膜或其他形态， 且工艺相对简单；⑶ 可通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改变表面性能； ④在体内外可缓慢降解；⑤对生物体无危险性。柞蚕丝素蛋白不但含有较多正电荷的氨基酸，而且还含RGD（精氨酸一甘氨酸一天门冬氨酸）三肽序列，有助于细胞锚定和黏附，对细胞的亲和性、黏附和增殖率明显高于桑蚕丝素蛋白已被证实[5-6]。本实验将柞蚕丝素蛋白和羟基磷灰石进行复合，目的在于改善支架的吸水率和降解率，提高支架对细胞黏附和增殖率。
本研究从吸水率、降解率、细胞粘附性等方面评估了TSF/HA复合支架材料的生物学特性，在研究中发现，与HA支架相比具有了更好的生物活性。但是如何控制柞蚕丝素蛋白溶液的浓度，与HA支架进行复合更有利于细胞黏附、生长和扩增，为更好修复骨缺损，仍需进一步研究。
参考文献：
[1] Rajan GP，Formaro J，Trentz O，et al.Cancellous allograft Versus autologous bone grafting for repait of comminuted distal radius fractures：a prospective，randomized trial.J Trauma.2006：60（6）：1322-1329.
[2] Ayerza MA， Aponte-Tinao LA，Abalo E， et al. Continuity and function of patellar tendon host-donor suture in tibial allograft.Clin orthop Relat Res. 2006；450：33-38.
[3] Sen MK，Miclau T. Autologous iliac crest bone graft： should it still be the gold standard for treating nonunions？ Injury. 2007；38 Suppl 1；S75-80.
[4] Johari A， Shingade V， Gajiwala AL， et al .The use of irradiated allograft in a padeiatric population：an Indian experience.cell Tissue Bank.2007；8（1）：13-12
[5] Muscolo DL，Ayerza MA，Aponte-Tinao LA，et al.Use of distal femoral osteoarticular allografts in limb salvage Surgery.Surgical technigue.J Bone Joint Surg Am.2006；88 Suppl 1 Pt 2：305-321.
[6] Wei Tao，Mingzhong Li，Chunxia Zhao.Structure and Properties of Regenerzted Antheraea pernyi silk fibroin in aqueous solution.International Journal of Biolgical Macromolecules，2007，40：472-478.
作者簡介：
刘贺国（1965.12-），男，主要从事骨组织工程修复骨缺损方面的研究和临床骨科的诊断和治疗工作。
基金支持：
本研究获得了辽宁省教育厅项目（L2011144）和辽宁医学院院内项目（Y2011Z022）项目支持。
通讯作者：
郑德宇（1973-），男，教授，硕士研究生导师，主要从事骨组织工程和神经退行性变的实验治疗。
【关键词】柞蚕丝素蛋白；羟基磷灰石；生物学特性
【中图分类号】R318 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0015—02
引言
各种创伤、肿瘤、感染等诸多原因导致骨缺损的病例不断增加，临床医生面临着巨大挑战。作为治疗骨缺损的“金标准”自体骨移植和“标准方法”[1-2]的同种异体骨移植，因其缺点如自体骨移植的骨来源有限、量不足、副损伤大、供区感染等；同种异体骨移植可传播疾病、免疫排斥反应、伦理等问题，导致两种骨移植方法受到限制。人们开始致力于骨替代材料的研究，我国自从上世纪80年代四川大学和武汉工业大学等根据人体骨无机成分的主要成分羟基磷灰石（HA），先后研制出了HA支架材料， 作为人体硬组织修复和替代组织工程材料，并很快的应用于临床。但因HA质脆、吸收性差、不易降解等临床使用受到限制。丝素蛋白具有独特机械特性和生物相容性，类似骨组织中的胶原，具有胶原的一些特性。柞蚕丝蛋白不但具有家蚕丝素蛋白的特性，而且还含有大量的 Arg-Gly-Asp（精氨酸-乙氨酸-天门冬氨酸，RGD）三肽序列。RGD序列作为细胞膜整合素受体与细胞外配体相结合的识别位点，介导细胞与细胞外基质及细胞之间的相互作用，能够促进支架对细胞的黏附。
本文采用冷冻干燥技术完成柞蚕丝蛋白对HA三维支架材料的修饰，通过体外降解实验、吸水测试及细胞粘附实验等观察，寻求一种理想的骨支架材料。
1 材料与方法
1.1 实验动物
由辽宁医学院动物实验中心提供出生24h内的乳兔1只。
1.2 实验方法
1.2.1 柞蚕丝蛋白/羟基磷灰石复合支架的制备：将羟基磷灰石多孔支架材料浸泡在浓度为12 g/L的柞蚕丝素蛋白水溶液中（本课题组制备测定保存），抽真空处理48h，然后移入-80℃冰箱冻结后，放入冷冻干燥仪进行冷冻干燥30 h。
1.2.2 兔骨髓间充质干细胞的复苏培养：取本室冻存的兔BMSCs，取出后立即置于的水浴箱中快速复温至保存液完全融化， 1000r/min离心10分钟，吸弃上清液，加入2ml完全培养液吹打管反复吹打底部细胞，重复离心一次，重悬细胞，按1×106/ml的密度接种于培养瓶中，置于37℃，50ml/L CO2饱和湿度条件下的培养箱进行培养，48h后换液，以后每隔2-3d换液一次。待细胞达80%融合后，0.25%胰酶消化，1：3传代。
1.2.3 细胞黏附实验：用0.25%胰蛋白酶消化分离对数生长期的细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/ml。将100μl细胞悬液种植到孔中覆盖有两种材料（直径13mm，厚1mm）的24孔细胞培养板，将细胞培养板置于培养箱中培养，分别培养5d、7d、9d后PBS轻轻洗3次以除去未贴壁的细胞，然后每孔加入0.5ml 0.25%胰蛋白酶消化各组材料上的细胞，轻轻吹打使细胞分散成单细胞悬液，在倒置显微镜下用血细胞计数板计数黏附于材料的细胞数，细胞黏附率计算公式如下：黏附率（%）=材料表面的黏附数/接种到材料表面总数×100%。
1.2.4扫描电镜观察支架的形态、孔径大小及细胞黏附生长情况：切取约2 mm厚的支架横截面，放光镜下观察支架的孔隙及孔径大小；切取支架样本，用导电双面胶粘在金属托架上，喷铂金后在扫描电镜下观察支架的结构。
1.2.5 支架吸水率测试：分别称取5枚TSF/HA复合支架和HA支架，称取原始支架重量，然后将其置于有蒸馏水的小烧杯中，分别浸泡0.5、2、6、12及24h，各时间点取出支架，用滤纸轻轻吸去表面多余水分，用电子天平称得吸水后的重量，取其均值。吸水率计算公式：吸水率=[（现重-初重）/现重]×100%。
1.2.6降解性测试：将支架材料切割成圆柱状（直径20.0mm，厚度5mm）备用。在50ml离心管中注入30mlPBS缓冲液（ pH 7.4 ），将已知重量的圆柱状支架材料放入离心管后密封，放置于37℃的恒温培养箱中。每隔2周取出支架蒸馏水冲洗，去除表面水分，冷冻干燥后称重，并测定离心管内降解液的pH值，半量更换PBS缓冲液。8周后取出样品，并計算降解率[3]。降解率=[（初重-现重）/初重]×100% 每次均做3个平行实验试样，取其平均值。
1.2.7 统计学分析：数据用 表示，数据处理应用SPSS 13.0统计软件包。采用析因分析及q检验两两比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SEM观察
TSF/HA材料孔隙壁粗糙，较多丝素蛋白颗粒；HA材料孔隙壁光滑。与BMSCs复合后，第三天见有微绒毛突起的细胞，细胞出现拉丝状物质，第七天时细胞几乎全部连接，分泌大量网状胶原。
2.2 TSF/HA与HA细胞粘附性
分别在5、7、9天后进行两种材料细胞粘附实验，对比图如下： 图1 细胞粘附对比图
复合支架在细胞接种5天时即表现出了良好的吸附性，同一时间点两组材料差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 TSF/HA与HA吸水率比较
同一时间点两种支架吸水性可以看出TSF/HA组高于HA组，其差异有统计学意义P <0.01，见表1。
2.4 TSF/HA与HA降解率比较
两种支架在体外降解过程中，其降解液的pH值基本稳定，8周结束时SF/HA支架降解液的pH值为6.78，HA支架降解液的pH值为6.82，基本保持了生理PH值，说明以上两种支架在降解过程中不会产生过酸、过碱有害物质。SF/HA支架的重量由8周前的1.08g降至现在的0.67g，HA支架由当初的1.07g降至现在的0.84g，根据公式得出SF/HA支架的降解率为38.06%，单纯支架的降解率为21.02%。TSF/HA支架的降解率明显好于HA支架的降解率，见图2：
图 2 SF/HA与HA降解对比图
3 讨论
随着组织工程学的发展，采用组织工程方法构建骨复合组织来了修复骨缺损进行不断的研究。在已往的研究中发现，HA是一种具有优良的生物相容性和生物活性的支架材料，但因其多孔陶瓷脆性大、韧性不足、力学性能差和不可降解的缺点，须通过不同的方法改善其性能。柞蚕丝素蛋白是从野生蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，它具有普通蚕丝蛋白的特点[4]： ①有独特的力学特性；②良好的吸湿性、透气性。可通过不同方法获得膜或其他形态， 且工艺相对简单；⑶ 可通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰较容易地改变表面性能； ④在体内外可缓慢降解；⑤对生物体无危险性。柞蚕丝素蛋白不但含有较多正电荷的氨基酸，而且还含RGD（精氨酸一甘氨酸一天门冬氨酸）三肽序列，有助于细胞锚定和黏附，对细胞的亲和性、黏附和增殖率明显高于桑蚕丝素蛋白已被证实[5-6]。本实验将柞蚕丝素蛋白和羟基磷灰石进行复合，目的在于改善支架的吸水率和降解率，提高支架对细胞黏附和增殖率。
本研究从吸水率、降解率、细胞粘附性等方面评估了TSF/HA复合支架材料的生物学特性，在研究中发现，与HA支架相比具有了更好的生物活性。但是如何控制柞蚕丝素蛋白溶液的浓度，与HA支架进行复合更有利于细胞黏附、生长和扩增，为更好修复骨缺损，仍需进一步研究。
参考文献：
[1] Rajan GP，Formaro J，Trentz O，et al.Cancellous allograft Versus autologous bone grafting for repait of comminuted distal radius fractures：a prospective，randomized trial.J Trauma.2006：60（6）：1322-1329.
[2] Ayerza MA， Aponte-Tinao LA，Abalo E， et al. Continuity and function of patellar tendon host-donor suture in tibial allograft.Clin orthop Relat Res. 2006；450：33-38.
[3] Sen MK，Miclau T. Autologous iliac crest bone graft： should it still be the gold standard for treating nonunions？ Injury. 2007；38 Suppl 1；S75-80.
[4] Johari A， Shingade V， Gajiwala AL， et al .The use of irradiated allograft in a padeiatric population：an Indian experience.cell Tissue Bank.2007；8（1）：13-12
[5] Muscolo DL，Ayerza MA，Aponte-Tinao LA，et al.Use of distal femoral osteoarticular allografts in limb salvage Surgery.Surgical technigue.J Bone Joint Surg Am.2006；88 Suppl 1 Pt 2：305-321.
[6] Wei Tao，Mingzhong Li，Chunxia Zhao.Structure and Properties of Regenerzted Antheraea pernyi silk fibroin in aqueous solution.International Journal of Biolgical Macromolecules，2007，40：472-478.
作者簡介：
刘贺国（1965.12-），男，主要从事骨组织工程修复骨缺损方面的研究和临床骨科的诊断和治疗工作。
基金支持：
本研究获得了辽宁省教育厅项目（L2011144）和辽宁医学院院内项目（Y2011Z022）项目支持。
通讯作者：
郑德宇（1973-），男，教授，硕士研究生导师，主要从事骨组织工程和神经退行性变的实验治疗。