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摘 要 为了更好地对橡胶树红根病病原菌进行鉴定，从海南省和云南省发病严重的胶园采集病害样本、分离得到12个灵芝属菌株，并对其rDNA-ITS序列绘制Ganoderma属系统发育树。结果表明，采集得到的12个菌株中有11个鉴定为Ganoderma philippii、1个鉴定为G. gibbosum。
关键词 橡胶树红根病；Ganoderma philippii；Ganoderma gibbosum
中图分类号 S432.1 文献标识码 A
Abstract With the aim to systemically phylogenetic analysis of pathogenic fungus causing Rubber Tree Red Root Rot Disease， twelve Ganoderma strains were isolated from Hainan and Yunnan. The rDNA-ITS sequences of the strains were amplified and used to construct phylogenetic tree together with other rDNA-ITS sequences of Ganoderma species in databases. The results showed that among these 12 strains， eleven of them belong to Ganoderma philippii and one of them belongs to G. gibbosum.
Key words Rubber tree red root rot disease； Ganoderma philippii； Ganoderma gibbosum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.024
橡胶树红根病是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）危害面积最广、损失最为严重的世界性橡胶树根部病害，在我国热区各个植胶区内普遍发生和为害。该病害的病原菌具有寄主多[1]、潜伏期长[2]、菌丝在土壤中蔓延迅速[3]和难防治的特点，危害橡胶树后严重影响干胶产量[4]，常常造成树体死亡，是威胁橡胶树产胶安全的重要因素之一。
目前，橡胶树红根病病原菌的鉴定主要以子实体外部形态、内部微观结构和孢子等形态学鉴定为主，Corner[5]于1931年将马来西亚橡胶树红根病病原菌鉴定为橡胶树灵芝[Ganoderma pseudoferreum（Wakef）Over.et Steinm]；张运强等[4，6]认为海南岛的橡胶树红根病与马来西亚橡胶树红根病的病原菌相同，但两者之间存在一定差异，可能存在2个变种；Steyaert[7]认为G. pseudoferreum是G. philippii（Bres.et.Henn）Bres.的同物异名；而国内赵继鼎[8]编著的《中国灵芝新编》中，把橡胶树红根病病原菌定为橡胶树舌（G. philippii）。
经典的形态分类学和现代分子系统学相结合的方法是目前用于灵芝鉴定的主要方法，如姚一建课题组[9]对我国野生和栽培灵芝进行鉴定，认为其正确名称应是四川灵芝（G. sichuanense J.D.Zhao&X.Q. Zhang），而非原产地在英国的灵芝（G. lucidum）。Cao等[10]通过结合形态学研究和rDNA-ITS序列分析的方法鉴定了我国栽培的灵芝（G. lucidum），并提出了一个新种G. lingzhi。可见，rDNA-ITS序列分析的方法可以用于灵芝属的种类鉴定，具有广泛的适用性。传统上对橡胶树红根病病原菌的鉴定主要依据子实体的形态与橡胶树受害状，而橡胶树感染病原菌前期并无子实体、受害状也不明显，给病原菌的快捷、有效鉴定带来一定的不便，有必要通过rDNA-ITS序列分析的方法，开展橡胶树红根病的鉴定。
为了对我国红根病病原菌进行进一步鉴定，笔者从海南省和云南省两大橡胶主产区内危害严重的胶园采集红根病病害样本并分离病原菌，形态分类学鉴定，扩增分离菌株的rDNA-ITS序列，通过基因组数据库比对，构建了包含Ganoderma属内已知种的系统进化树，从分子系统学的角度对橡胶树红根病病原菌进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 使用Ganoderma属内9个种50个不同来源的菌株绘制系统发育树，菌株编号包含“CATAS”的为笔者从橡胶树红根病病组织分离获得，供试菌株信息见表1。
1.1.2 药品或试剂 OMEGA真菌DNA小量提取试剂盒（纯化方式：硅胶柱）；真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4由上海英骏生物技术有限公司合成，纯化方式为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳）；Taq DNA Polymerase试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pMD18-T Vector试剂盒均由宝生物工程（大连）有限公司生产；核酸染料Goldview：北京赛百盛基因技术有限公司。
1.1.3 试验仪器设备 PCR仪：德国Biometra公司，型号为T1 Thermocycler的用于普通PCR反应；电泳仪：北京六一电泳仪器厂，型号为DYCP-31E；其他仪器均为实验室常规仪器。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 在橡胶树红根病发病的胶园内挖取染病、木质部尚未腐烂的病根，带回室内进行组织分离。清水洗净病根表面的土壤，晾干后至于无菌操作台中，手术刀挖取紧邻木质部的韧皮部部分，放置在1 mg/mL链霉素溶液中、浸洗1 min后，无菌水润洗3次后将组织块移至玉米粉橡胶根汁培养基中[11]，28 ℃恒温培养、纯化。 1.2.2 病原菌基因组总DNA的提取和rDNA-ITS区段PCR扩增 病原菌基因组总DNA的提取采用OMEGA真菌DNA小量提取试剂盒（纯化方式：硅胶柱），参照说明书进行提取。根据White等[12]报道的真菌rDNA-ITS通用引物对序列设计PCR引物：ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，以病原菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增，预期产物约640 bp。25 μL扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL，1.5 mmol/L MgCl2 2.5 μL，10 μmol/L dNTPs 2.0 μL，每条引物（20 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶5 U/μL（TaKaRa Biotech）0.2 μL，模板DNA 20.0 ng，灭菌双蒸水补足至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物，Gold View（北京赛百盛生物工程公司）染色分析，紫外灯下观察。
1.2.3 病原菌rDNA-ITS区段的克隆与测序 PCR产物回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa），按试剂盒说明书进行操作。使用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，将回收产物与pMD18-T Vector 经T4 DNA 连接酶连接后转化Escherichia coli DH5a感受态细胞。用含氨苄青霉素的X-gal/IPTG/LB平板进行蓝白斑筛选，并将成功克隆的质粒送上海英骏生物科技有限公司测序，所得序列提交至GenBank，获得登录号。
1.2.4 病原菌rDNA-ITS区段的序列分析及系统发育树的构建 将测序得到的rDNA-ITS序列与GenBank中的序列经BLASTn比对、同源序列分析并下载Ganoderma属的G. philippii、G.sichuanense、G. multipileum、G. lucidum、G. tropicum、G. resinaceum、G. mastoporum、G. weberanum和G. gibbosum等9个种的38个rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2对序列进行系统进化分析，采用最大简约法（Maximum Parsimony，MP）绘制系统发育树，重复次数为1 000次。所选Ganoderma属rDNA-ITS序列GenBank登录号见表1。依据Moncalvo等[13]灵芝属rDNA-ITS序列种内差异小于2%的观点，判别橡胶树红根病病原菌菌株是否为同一种。
2 结果与分析
2.1 病原菌分离结果
通过对云南省和海南省两大主产区内红根病发病严重的胶园进行病原菌的分离纯化，共得到12个菌株，结合橡胶树病根形态与菌落特征，初步鉴定为Ganoderma属，菌株编号分别为CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018、CATAS-Gp-020和CATAS-Gg-010，菌株采集地见表1。
2.2 rDNA-ITS区段的PCR扩增、克隆与测序结果
PCR产物和切胶回收产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，菌株编号为CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和CATAS-Gp-020等11个菌株获得1条大小为640 bp的扩增条带，与期望值基本相符，而菌株编号为CATAS-Gg-010获得1条大小为655 bp的扩增条带。所有序列与GenBank中的序列经BLASTn比对、同源性分析显示，均与Ganoderma属的其他种有非常高的同源性，达99%以上。
2.3 rDNA-ITS序列的系统发育分析
通过对GenBank上的Ganoderma属的38个rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2对序列进行系统进化树分析，采用最大简约法（Maximum Parsimony，MP）绘制系统发育树。结果表明（图1），所绘制的系统发育树包含了Ganoderma属内的9个种，同一个种内的不同菌株的rDNA-ITS序列虽有差异，但仍会聚集在同一个分支，如G. sichuanense（四川灵芝）的11个菌株。供试的CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和CATAS-Gp-020等11个菌株与来自马来西亚和印度尼西亚的G. pilippii（橡胶树舌）的3个菌株聚为同一个分支、菌株之间的rDNA-ITS差异十分小。供试的CATAS-Gg-010菌株与来自中国和印度的13个G. gibbosum（有柄灵芝）菌株，聚为1个较大的分支，其中菌株AS5.624-T4和CATAS-Gg-010各自单独形成一个分支，而其余的12个菌株聚为一个分支。
3 讨论与结论
通过对云南省景洪市、勐腊县、河口县、红河州，海南省琼中县、乐东县的橡胶树红根病发病胶园分离得到Ganoderma属的12个菌株，使用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4扩增其序列，经测序发现，12个菌株中11个菌株的rDNA-ITS序列大小为640 bp，而菌株CATAS-Gg-010的rDNA-ITS序列大小为655 bp，表明12个菌株可能由2个类群组成。 在GenBank下载Ganoderma属的9个种38个菌株的rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2软件绘制MP法系统发育树发现，rDNA-ITS序列大小为640 bp的11个菌株与3个G. philippii菌株聚为同一个分支，二者之间的亲缘关系十分近似，同源性达99%以上，可能是同一个种，这与Steyaert所认为的G. pseudoferreum是G. philippii的同物异名的结论一致[7]，而赵继鼎[8]也把橡胶树红根病的病原菌定为G. philippii。该分支可细分为两个小分支，一个是包含CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和3个G. philippii菌株，一个仅包含CATAS-Gp-020和CATAS-Gp-012两个菌株，涂敏等[14]通过RAPD的方法研究红根病病原菌的遗传多样性时，认为红根病病原菌可分为两个类群，说明该病原菌已经存在遗传分化。两个小分支所包含的菌株之间亲缘关系虽近，但并非是采集于同一个地区，而是跨越云南和海南两省的6个市县，至于2个小分支是否达到变种的水平，仍需进一步的研究。
菌株CATAS-Gg-010与13个来自印度与中国的G. gibbosum菌株聚为1个大的分支，亲缘关系较近，同源性达98%以上，而菌株CATAS-Gg-010与G. philippii的同源性低于90%，说明CATAS-Gg-010属于G. gibbosum种群，而不属于G. philippii这个种群。G. gibbosum，中文名称为有柄灵芝（别名：有柄树舌），在黑龙江、河北、陕西、江苏、浙江、湖北、贵州、云南、广东、广西和海南等省区分布[15]。吴兴亮等[16]通过对海南岛灵芝资源的调查发现，G. gibbosum在海南岛广泛分布于常绿季雨林、低山雨林和人工林中。菌株CATAS-Gg-010与CATAS-Gp-009均采集于云南省河口县蚂蝗堡农场的橡胶园内，但二者并不是同一种灵芝属真菌。笔者首次从橡胶树红根病典型症状的根部分离获得有柄灵芝（G. gibbosum）菌株，但其是否对健康的橡胶树具有致病性，仍有待进一步的柯赫氏法则验证。
参考文献
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[7] Steyaert R L. Species of Ganoderma and related genera mainly of Bogor and leiden herboria[J]. Persoonia， 1972（7）： 55-118.
[8] 赵继鼎. 中国灵芝新编[M]. 北京： 科学出版社， 1989： 77-79.
[9] Wang X C， Xi R J， Li Y， et al. The species identity of the widely cultivated Ganoderma，‘G. lucidum’（Ling-zhi）， in China[J]. PloS ONE， 2012， 7（7）： e40857.
[10] Cao Y， Wu S H， Dai Y C. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom‘Lingzhi’[J]. Fungal Diversity， 2012， 56： 49-62.
[11] 张 贺， 蒲金基， 张 欣， 等. 橡胶树红根病病原菌生物学培养特性[J]. 热带作物学报， 2008， 29（5）： 632-635.
[12] White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. // PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M]. Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. New York： Academic Press， Inc.， 1990： 315-322.
[13] Moncalvo J M， Wang H H， Hseu R S. Phylogenetic relationships in Ganoderma inferred from the internal transcribed spacers and 25s ribosomal DNA sequences[J]. Mycologia， 1995， 87（2）： 223-238.
[14] 涂 敏， 蔡海滨， 皮彩霞， 等. 橡胶树红根病菌遗传多态性的RAPD分析[C]. 中国植物病理学会2012年学术年会论文集， 2012： 584-589.
[15] 吴兴亮， 宋 斌， 赵友兴， 等. 中国药用灵芝及名称使用商榷[J]. 贵州科学， 2013， 31（1）： 1-17.
[16] 吴兴亮， 郭建荣， 廖其珍， 等. 中国海南岛灵芝资源及其分布特征[J]. 菌物系统， 1998， 17（2）： 122-129.
关键词 橡胶树红根病；Ganoderma philippii；Ganoderma gibbosum
中图分类号 S432.1 文献标识码 A
Abstract With the aim to systemically phylogenetic analysis of pathogenic fungus causing Rubber Tree Red Root Rot Disease， twelve Ganoderma strains were isolated from Hainan and Yunnan. The rDNA-ITS sequences of the strains were amplified and used to construct phylogenetic tree together with other rDNA-ITS sequences of Ganoderma species in databases. The results showed that among these 12 strains， eleven of them belong to Ganoderma philippii and one of them belongs to G. gibbosum.
Key words Rubber tree red root rot disease； Ganoderma philippii； Ganoderma gibbosum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.024
橡胶树红根病是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）危害面积最广、损失最为严重的世界性橡胶树根部病害，在我国热区各个植胶区内普遍发生和为害。该病害的病原菌具有寄主多[1]、潜伏期长[2]、菌丝在土壤中蔓延迅速[3]和难防治的特点，危害橡胶树后严重影响干胶产量[4]，常常造成树体死亡，是威胁橡胶树产胶安全的重要因素之一。
目前，橡胶树红根病病原菌的鉴定主要以子实体外部形态、内部微观结构和孢子等形态学鉴定为主，Corner[5]于1931年将马来西亚橡胶树红根病病原菌鉴定为橡胶树灵芝[Ganoderma pseudoferreum（Wakef）Over.et Steinm]；张运强等[4，6]认为海南岛的橡胶树红根病与马来西亚橡胶树红根病的病原菌相同，但两者之间存在一定差异，可能存在2个变种；Steyaert[7]认为G. pseudoferreum是G. philippii（Bres.et.Henn）Bres.的同物异名；而国内赵继鼎[8]编著的《中国灵芝新编》中，把橡胶树红根病病原菌定为橡胶树舌（G. philippii）。
经典的形态分类学和现代分子系统学相结合的方法是目前用于灵芝鉴定的主要方法，如姚一建课题组[9]对我国野生和栽培灵芝进行鉴定，认为其正确名称应是四川灵芝（G. sichuanense J.D.Zhao&X.Q. Zhang），而非原产地在英国的灵芝（G. lucidum）。Cao等[10]通过结合形态学研究和rDNA-ITS序列分析的方法鉴定了我国栽培的灵芝（G. lucidum），并提出了一个新种G. lingzhi。可见，rDNA-ITS序列分析的方法可以用于灵芝属的种类鉴定，具有广泛的适用性。传统上对橡胶树红根病病原菌的鉴定主要依据子实体的形态与橡胶树受害状，而橡胶树感染病原菌前期并无子实体、受害状也不明显，给病原菌的快捷、有效鉴定带来一定的不便，有必要通过rDNA-ITS序列分析的方法，开展橡胶树红根病的鉴定。
为了对我国红根病病原菌进行进一步鉴定，笔者从海南省和云南省两大橡胶主产区内危害严重的胶园采集红根病病害样本并分离病原菌，形态分类学鉴定，扩增分离菌株的rDNA-ITS序列，通过基因组数据库比对，构建了包含Ganoderma属内已知种的系统进化树，从分子系统学的角度对橡胶树红根病病原菌进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 使用Ganoderma属内9个种50个不同来源的菌株绘制系统发育树，菌株编号包含“CATAS”的为笔者从橡胶树红根病病组织分离获得，供试菌株信息见表1。
1.1.2 药品或试剂 OMEGA真菌DNA小量提取试剂盒（纯化方式：硅胶柱）；真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4由上海英骏生物技术有限公司合成，纯化方式为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳）；Taq DNA Polymerase试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pMD18-T Vector试剂盒均由宝生物工程（大连）有限公司生产；核酸染料Goldview：北京赛百盛基因技术有限公司。
1.1.3 试验仪器设备 PCR仪：德国Biometra公司，型号为T1 Thermocycler的用于普通PCR反应；电泳仪：北京六一电泳仪器厂，型号为DYCP-31E；其他仪器均为实验室常规仪器。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 在橡胶树红根病发病的胶园内挖取染病、木质部尚未腐烂的病根，带回室内进行组织分离。清水洗净病根表面的土壤，晾干后至于无菌操作台中，手术刀挖取紧邻木质部的韧皮部部分，放置在1 mg/mL链霉素溶液中、浸洗1 min后，无菌水润洗3次后将组织块移至玉米粉橡胶根汁培养基中[11]，28 ℃恒温培养、纯化。 1.2.2 病原菌基因组总DNA的提取和rDNA-ITS区段PCR扩增 病原菌基因组总DNA的提取采用OMEGA真菌DNA小量提取试剂盒（纯化方式：硅胶柱），参照说明书进行提取。根据White等[12]报道的真菌rDNA-ITS通用引物对序列设计PCR引物：ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，以病原菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增，预期产物约640 bp。25 μL扩增体系：10×PCR buffer 2.5 μL，1.5 mmol/L MgCl2 2.5 μL，10 μmol/L dNTPs 2.0 μL，每条引物（20 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA聚合酶5 U/μL（TaKaRa Biotech）0.2 μL，模板DNA 20.0 ng，灭菌双蒸水补足至25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物，Gold View（北京赛百盛生物工程公司）染色分析，紫外灯下观察。
1.2.3 病原菌rDNA-ITS区段的克隆与测序 PCR产物回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa），按试剂盒说明书进行操作。使用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，将回收产物与pMD18-T Vector 经T4 DNA 连接酶连接后转化Escherichia coli DH5a感受态细胞。用含氨苄青霉素的X-gal/IPTG/LB平板进行蓝白斑筛选，并将成功克隆的质粒送上海英骏生物科技有限公司测序，所得序列提交至GenBank，获得登录号。
1.2.4 病原菌rDNA-ITS区段的序列分析及系统发育树的构建 将测序得到的rDNA-ITS序列与GenBank中的序列经BLASTn比对、同源序列分析并下载Ganoderma属的G. philippii、G.sichuanense、G. multipileum、G. lucidum、G. tropicum、G. resinaceum、G. mastoporum、G. weberanum和G. gibbosum等9个种的38个rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2对序列进行系统进化分析，采用最大简约法（Maximum Parsimony，MP）绘制系统发育树，重复次数为1 000次。所选Ganoderma属rDNA-ITS序列GenBank登录号见表1。依据Moncalvo等[13]灵芝属rDNA-ITS序列种内差异小于2%的观点，判别橡胶树红根病病原菌菌株是否为同一种。
2 结果与分析
2.1 病原菌分离结果
通过对云南省和海南省两大主产区内红根病发病严重的胶园进行病原菌的分离纯化，共得到12个菌株，结合橡胶树病根形态与菌落特征，初步鉴定为Ganoderma属，菌株编号分别为CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018、CATAS-Gp-020和CATAS-Gg-010，菌株采集地见表1。
2.2 rDNA-ITS区段的PCR扩增、克隆与测序结果
PCR产物和切胶回收产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，菌株编号为CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和CATAS-Gp-020等11个菌株获得1条大小为640 bp的扩增条带，与期望值基本相符，而菌株编号为CATAS-Gg-010获得1条大小为655 bp的扩增条带。所有序列与GenBank中的序列经BLASTn比对、同源性分析显示，均与Ganoderma属的其他种有非常高的同源性，达99%以上。
2.3 rDNA-ITS序列的系统发育分析
通过对GenBank上的Ganoderma属的38个rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2对序列进行系统进化树分析，采用最大简约法（Maximum Parsimony，MP）绘制系统发育树。结果表明（图1），所绘制的系统发育树包含了Ganoderma属内的9个种，同一个种内的不同菌株的rDNA-ITS序列虽有差异，但仍会聚集在同一个分支，如G. sichuanense（四川灵芝）的11个菌株。供试的CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-012、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和CATAS-Gp-020等11个菌株与来自马来西亚和印度尼西亚的G. pilippii（橡胶树舌）的3个菌株聚为同一个分支、菌株之间的rDNA-ITS差异十分小。供试的CATAS-Gg-010菌株与来自中国和印度的13个G. gibbosum（有柄灵芝）菌株，聚为1个较大的分支，其中菌株AS5.624-T4和CATAS-Gg-010各自单独形成一个分支，而其余的12个菌株聚为一个分支。
3 讨论与结论
通过对云南省景洪市、勐腊县、河口县、红河州，海南省琼中县、乐东县的橡胶树红根病发病胶园分离得到Ganoderma属的12个菌株，使用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4扩增其序列，经测序发现，12个菌株中11个菌株的rDNA-ITS序列大小为640 bp，而菌株CATAS-Gg-010的rDNA-ITS序列大小为655 bp，表明12个菌株可能由2个类群组成。 在GenBank下载Ganoderma属的9个种38个菌株的rDNA-ITS序列，采用MEGA5.2软件绘制MP法系统发育树发现，rDNA-ITS序列大小为640 bp的11个菌株与3个G. philippii菌株聚为同一个分支，二者之间的亲缘关系十分近似，同源性达99%以上，可能是同一个种，这与Steyaert所认为的G. pseudoferreum是G. philippii的同物异名的结论一致[7]，而赵继鼎[8]也把橡胶树红根病的病原菌定为G. philippii。该分支可细分为两个小分支，一个是包含CATAS-Gp-002、CATAS-Gp-003、CATAS-Gp-005、CATAS-Gp-008、CATAS-Gp-009、CATAS-Gp-011、CATAS-Gp-013、CATAS-Gp-014、CATAS-Gp-018和3个G. philippii菌株，一个仅包含CATAS-Gp-020和CATAS-Gp-012两个菌株，涂敏等[14]通过RAPD的方法研究红根病病原菌的遗传多样性时，认为红根病病原菌可分为两个类群，说明该病原菌已经存在遗传分化。两个小分支所包含的菌株之间亲缘关系虽近，但并非是采集于同一个地区，而是跨越云南和海南两省的6个市县，至于2个小分支是否达到变种的水平，仍需进一步的研究。
菌株CATAS-Gg-010与13个来自印度与中国的G. gibbosum菌株聚为1个大的分支，亲缘关系较近，同源性达98%以上，而菌株CATAS-Gg-010与G. philippii的同源性低于90%，说明CATAS-Gg-010属于G. gibbosum种群，而不属于G. philippii这个种群。G. gibbosum，中文名称为有柄灵芝（别名：有柄树舌），在黑龙江、河北、陕西、江苏、浙江、湖北、贵州、云南、广东、广西和海南等省区分布[15]。吴兴亮等[16]通过对海南岛灵芝资源的调查发现，G. gibbosum在海南岛广泛分布于常绿季雨林、低山雨林和人工林中。菌株CATAS-Gg-010与CATAS-Gp-009均采集于云南省河口县蚂蝗堡农场的橡胶园内，但二者并不是同一种灵芝属真菌。笔者首次从橡胶树红根病典型症状的根部分离获得有柄灵芝（G. gibbosum）菌株，但其是否对健康的橡胶树具有致病性，仍有待进一步的柯赫氏法则验证。
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