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[摘 要]目的建立橘核中橙皮苷含量的测定方法，为橘核的质量评价与控制提供科学依据。方法 采用HPLC法进行测定。色谱柱：Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-36%（体积分数）乙酸-水（体积比38∶2∶60）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：285 nm；柱温： 25 ℃。结果 橙皮苷在0.103～2. 060μg范围内线性关系良好，r=0.9999，平均回收率为95.87%（n=6），RSD=2.46%，3批橘核中橙皮苷含量介于0.1～0.2 mg·g-1之间。结论 该方法简便、准确，可作为橘核中橙皮苷的定量分析和质量控制方法。
[关键词]橘核；橙皮苷；含量测定；质量控制；高效液相色谱法
中图分类号：O657.91文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）17-0190-01
橘核为芸香科植物橘Citrus reticuluta Blanco及其栽培变种的种子，其味苦，平。归肝、肾经。具有理气、散结、止痛的功效，临床可用于治疗小肠疝气，睾丸肿痛，乳痈肿痛。橘核中含有橙皮苷和柠檬苦素类物质等。目前橘核的质量控制尚缺乏较全面统一的标准，虽已有关于橘核中柠檬苦素类物质含量测定的报道，但柠檬苦素类物质很难得到纯度较高的单体化合物，故将其作为质控指标仍存在一定的局限性。《中国药典》2010版一部[橘核]项下描述“橘核子叶细胞显微观察可见针簇状橙皮苷结晶”，可见橙皮苷是橘核质量控制的指标之一，值得深入研究。橙皮苷具有明确的药理作用，如：维持渗透压、增强毛细血管韧性、缩短出血时间、降低胆固醇等，在临床上可用于心血管系统疾病的辅助治疗，可配制多种防止动脉硬化和心肌梗死的药物，是成药“脉通”的主要原料之一。此外，橙皮苷氢化后是天然甜味剂二氢查尔酮，其甜度是蔗糖的1 000倍，可用于开发功能性食品。
本研究旨在建立橘核中橙皮苷的含量测定方法，为橘核质量的评价与控制提供科学依据，为其应用范围的进一步扩大奠定理论基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
天美LC2000型高效液相色谱仪（LC2030检测器、LC2130泵、L-2200自动进样器），T2000P色谱工作站；BP211D型电子分析天平（德国sartorius 公司），LK-400药用粉碎机（浙江城关红利数控制造厂）。
1.2 试药
橙皮苷对照品（批号：110721-200613，供含量测定用）购自中国药品生物制品检定所；橘核药材分别购自广东康美药业（1）、广州致信药业（2）及广州市采芝林连锁药店（3），经广州中医药大学中药学院陈康教授鉴定皆为橘Citri Reticulatae Blanco的干燥种子；流动相所用甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的橙皮苷对照品2.06 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，制成每1 mL含橙皮苷0.206 mg的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备取经粉碎机粉碎的橘核粉末约1 g，精密稱定，用石油醚100 mL索氏提取4.5 h，滤渣挥干石油醚，置圆底烧瓶中，加甲醇20 mL，水浴加热回流1 h，静置冷却至室温，滤过，滤渣再加甲醇20 mL重复提取1次，合并2次滤液，浓缩定容至 10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2 色谱条件与系统适用性
色谱柱：安谱公司Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-36%（体积分数）乙酸-水（体积比38∶2∶60）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：285 nm；柱温：25 ℃。分别精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图。
2.3 线性关系考察
精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液 0.5、1、2.5、5、7.5、10 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL进样。按“2.2”项下色谱条件进行测定，测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，橙皮苷对照品进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=2×106X-1.4823×104，r=0.999 9。结果表明，橙皮苷在0.103～2.060 μg之间线性关系良好。
2.4 精密度试验
精密吸取橙皮苷对照品溶液（0.206 mg·mL-1）10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定橙皮苷色谱峰峰面积，RSD为1.82%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.5 重复性试验
取第3批的橘核样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10μL，测定橙皮苷峰面积，计算含量，其RSD为2.50%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液（第3批），分别在0、3、6、12、18、24 h精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定橙皮苷峰面积，计算含量，其RSD为1.76%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7 回收率试验
取已知橙皮苷质量的样品（第1批）6份，每份取约1 g，精密称定。分别准确加入质量浓度为0.206 mg·mL-1的橙皮苷对照品溶液1 mL，混合后挥干甲醇。按“2.1.2”项下方法制备回收率供试样品溶液，依法进行测定，计算回收率。
2.8 样品测定
取3批橘核样品，每批3份，精密称定，测定其含水量，同时按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定其橙皮苷含量，结合含水量分别计算样品中橙皮苷净含量。3批橘核中橙皮苷质量分数分别为0.17、0.18、0.11 mg·g-1，RSD值分别为2.25%、2.06%和1.80%。
3 讨论
橘核为种子类药材，富含脂肪油。试验对脱脂后甲醇提取样品溶液和不经脱脂直接用甲醇提取的样品溶液进行了比较研究，结果发现未经脱脂而直接提取的样品干扰成分较多，峰形较差。此外，样品中的脂肪油对柱体污染性较强，所以制备样品溶液时应该先以石油醚脱脂，再以甲醇提取。
试验对常用的流动相系统如甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水及各系统组分不同比例间进行了比较，结果表明采用甲醇-36%（体积分数）乙酸-水（体积比38∶2∶60）进行洗脱效果为佳。在该条件下橙皮苷分离度良好，峰形窄而对称，且不受其他峰的干扰。
本实验建立的方法简便、准确，可用于橘核中橙皮苷含量的测定，对于橘核及其产品的质量控制、质量标准的补充完善均具有重要意义。
参考文献
[1] 橙皮苷作用[EB/OL].http：//baike.baidu.com/view/91385.2010-05-26[2010-08-04].
[2] 新型甜味剂的应用及前景[EB/OL].http：//qkeli.cn/qkeliExpert/ qkeliPatent/2009/0203/818.html.2009-02-03[2010-08-04].
[关键词]橘核；橙皮苷；含量测定；质量控制；高效液相色谱法
中图分类号：O657.91文献标识码：A文章编号：1009-914X（2013）17-0190-01
橘核为芸香科植物橘Citrus reticuluta Blanco及其栽培变种的种子，其味苦，平。归肝、肾经。具有理气、散结、止痛的功效，临床可用于治疗小肠疝气，睾丸肿痛，乳痈肿痛。橘核中含有橙皮苷和柠檬苦素类物质等。目前橘核的质量控制尚缺乏较全面统一的标准，虽已有关于橘核中柠檬苦素类物质含量测定的报道，但柠檬苦素类物质很难得到纯度较高的单体化合物，故将其作为质控指标仍存在一定的局限性。《中国药典》2010版一部[橘核]项下描述“橘核子叶细胞显微观察可见针簇状橙皮苷结晶”，可见橙皮苷是橘核质量控制的指标之一，值得深入研究。橙皮苷具有明确的药理作用，如：维持渗透压、增强毛细血管韧性、缩短出血时间、降低胆固醇等，在临床上可用于心血管系统疾病的辅助治疗，可配制多种防止动脉硬化和心肌梗死的药物，是成药“脉通”的主要原料之一。此外，橙皮苷氢化后是天然甜味剂二氢查尔酮，其甜度是蔗糖的1 000倍，可用于开发功能性食品。
本研究旨在建立橘核中橙皮苷的含量测定方法，为橘核质量的评价与控制提供科学依据，为其应用范围的进一步扩大奠定理论基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
天美LC2000型高效液相色谱仪（LC2030检测器、LC2130泵、L-2200自动进样器），T2000P色谱工作站；BP211D型电子分析天平（德国sartorius 公司），LK-400药用粉碎机（浙江城关红利数控制造厂）。
1.2 试药
橙皮苷对照品（批号：110721-200613，供含量测定用）购自中国药品生物制品检定所；橘核药材分别购自广东康美药业（1）、广州致信药业（2）及广州市采芝林连锁药店（3），经广州中医药大学中药学院陈康教授鉴定皆为橘Citri Reticulatae Blanco的干燥种子；流动相所用甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的橙皮苷对照品2.06 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，制成每1 mL含橙皮苷0.206 mg的对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备取经粉碎机粉碎的橘核粉末约1 g，精密稱定，用石油醚100 mL索氏提取4.5 h，滤渣挥干石油醚，置圆底烧瓶中，加甲醇20 mL，水浴加热回流1 h，静置冷却至室温，滤过，滤渣再加甲醇20 mL重复提取1次，合并2次滤液，浓缩定容至 10 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2 色谱条件与系统适用性
色谱柱：安谱公司Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-36%（体积分数）乙酸-水（体积比38∶2∶60）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：285 nm；柱温：25 ℃。分别精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图。
2.3 线性关系考察
精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液 0.5、1、2.5、5、7.5、10 mL，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL进样。按“2.2”项下色谱条件进行测定，测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，橙皮苷对照品进样量（X）为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y=2×106X-1.4823×104，r=0.999 9。结果表明，橙皮苷在0.103～2.060 μg之间线性关系良好。
2.4 精密度试验
精密吸取橙皮苷对照品溶液（0.206 mg·mL-1）10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定橙皮苷色谱峰峰面积，RSD为1.82%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.5 重复性试验
取第3批的橘核样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10μL，测定橙皮苷峰面积，计算含量，其RSD为2.50%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.6 稳定性试验
取同一份供试品溶液（第3批），分别在0、3、6、12、18、24 h精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定橙皮苷峰面积，计算含量，其RSD为1.76%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7 回收率试验
取已知橙皮苷质量的样品（第1批）6份，每份取约1 g，精密称定。分别准确加入质量浓度为0.206 mg·mL-1的橙皮苷对照品溶液1 mL，混合后挥干甲醇。按“2.1.2”项下方法制备回收率供试样品溶液，依法进行测定，计算回收率。
2.8 样品测定
取3批橘核样品，每批3份，精密称定，测定其含水量，同时按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定其橙皮苷含量，结合含水量分别计算样品中橙皮苷净含量。3批橘核中橙皮苷质量分数分别为0.17、0.18、0.11 mg·g-1，RSD值分别为2.25%、2.06%和1.80%。
3 讨论
橘核为种子类药材，富含脂肪油。试验对脱脂后甲醇提取样品溶液和不经脱脂直接用甲醇提取的样品溶液进行了比较研究，结果发现未经脱脂而直接提取的样品干扰成分较多，峰形较差。此外，样品中的脂肪油对柱体污染性较强，所以制备样品溶液时应该先以石油醚脱脂，再以甲醇提取。
试验对常用的流动相系统如甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水及各系统组分不同比例间进行了比较，结果表明采用甲醇-36%（体积分数）乙酸-水（体积比38∶2∶60）进行洗脱效果为佳。在该条件下橙皮苷分离度良好，峰形窄而对称，且不受其他峰的干扰。
本实验建立的方法简便、准确，可用于橘核中橙皮苷含量的测定，对于橘核及其产品的质量控制、质量标准的补充完善均具有重要意义。
参考文献
[1] 橙皮苷作用[EB/OL].http：//baike.baidu.com/view/91385.2010-05-26[2010-08-04].
[2] 新型甜味剂的应用及前景[EB/OL].http：//qkeli.cn/qkeliExpert/ qkeliPatent/2009/0203/818.html.2009-02-03[2010-08-04].