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摘要[目的] 建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法。[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STPpBC1进行线性化，采用脂质体法转染山羊成纤维细胞，以期获得转基因阳性细胞。[结果] 采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后，通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞；转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰，其生长曲线呈现正常的“S”；转基因阳性细胞经冷冻复苏后，仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线；PCR鉴定结果表明 ，STPpBC1已整合入转基因细胞的基因组中。[结论] 成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株。
关键词山羊；乳腺特异表达载体；Brazzein基因；转基因细胞
中图分类号S827文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08099-03
The Screening and Identification of Transgenic Goat Fibroblast Cells with Sweet Protein Brazzein Gene
WANG Chunsheng， AN Tiezhu et al （College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] In order to obtain transgenic goat fibroblast cells with sweet protein Brazzein gene. [Method] Goat fibroblast cells were transfected with mammary gland specific expression vector STPpBC1 constructed in the previous work by cationic liposome method and cultured G418resistant cell. After PCR identified， transgenic cell line with Tem was established. The G418 positive cells were detected. [Result] Transgenic cell could be obtained by the optimum concentration of G418. Morphology of the transgenic cell and transgenic cells after freezingthawing was similar with normal mammary epithelial cells， the cell growth curve was “S” shape， PCR results showed that the vector constructed was integrated into genome. [Conclusion] The transgenic cells with temporinGFP were filtrated， and lay the foundation for the transgenic goat with expression temporin in mammary.
Key words Goat； Mammary gland specific expression vector； Brazzein gene； Transgenic cell
甜味蛋白Brazzein是西非野生植物Pentadiplandra brazzeana外果皮和種子之间形成的一种蛋白，具有极高的与糖类相似甜味，但其含量仅为果实干重的0.02%～005%[1]。因此，通过植物难以获得大量的Brazzein蛋白。如果采用转基因的方法，就能通过动物等生物反应器获取大量的Brazzein蛋白。为了通过山羊乳汁获取Brazzein蛋白，笔者利用前期工作[2]中构建的山羊乳腺特异Brazzein基因真核表达转染山羊成纤维细胞，以期获得转Brazzein基因阳性细胞株，为建立通过体细胞移植方法培育乳腺特异表达Brazzein的山羊奠定基础。
1材料与方法
1.1山羊皮肤成纤维细胞的培养采取约10日龄幼山羊耳廓皮肤组织，采用常规方法，用CO2培养箱（38 ℃、5%CO2、100%湿度），以DMEM（含10%胎牛血清）培养液原代培养山羊皮肤成纤维细胞，并进行3～4代的传代培养。
1.2最适G418浓度的筛选用分别含有1 000、800、600、400、200、100 和50 μg/μl G418 的DMEM（含10%胎牛血清）培养液培养“1.1”中传代培养的山羊皮肤成纤维细胞，根据细胞存活状态，确定筛选阳性细胞的最佳G418浓度。
1.3Brazzein基因真核表达载体的线性化在前期工作[2]中已获得山羊乳腺特异表达Brazzein基因的真核表达载体，即根据GenBank中甜味蛋白Brazzein基因的mRNA序列（A95587），人工合成Brazzein基因pUC57质粒（命名为STpUC57）；以ST pUC57质粒作为模板，TP1（5′GTCGACATGGCTAAGTTTGCTTCT3′）和TP2（5′GTCGACTTAGTATTCGCAGTAATC3′）为引物，利用rTaq DNA Polymerase进行梯度PCR扩增，对目的条带进行胶回收，并连接到pMD18Simple载体上，获得被命名为STPpMD18Simple的表达载体；利用Sal1酶对STPpMD18Simple进行单酶双酶切，并用Gel Extraction Kit胶回收试剂盒进行胶回收，获得甜味蛋白Brazzein基因片段；用Xho1酶单酶切乳腺特性载体pBC1获得线性化乳腺特性载体pBC1载体；Brazzein基因和线性化的山羊乳腺特异性pBC1载体进行连接转化后，获得乳腺特异的Brazzein基因真核表达载体（命名为STPpBC1）。将STPpBC1利用NotI酶进行单酶切后进行线性化。 1.4山羊皮肤成纤维细胞的转染将“1.1”中传代培养的山羊成纤维细胞，用无抗生素的DMEM（含10%胎牛血清）培养液进行培养，当细胞达到60%～70%后，根据脂质体Lipofect Transfect Reagen（Tiangen）说明，用上述线性化的STPpBC1进行转染。
1.5转基因阳性细胞的筛选将“1.4”中用线性化STPpBC1转染的山羊成纤维细胞，在含有“1.3”中筛选的G418 浓度的DMEM（ 含10%胎牛血清） 溶液中培养，在倒置显微镜下，每隔24 h 观察细胞形态和存活状态，当未转染细胞全部死亡后，再用含G418 的培养液继续筛选7 d，最后用无G418 的培养液传代培养，观察计算并绘制细胞生长曲线（ 每个时间点设3个重复）。
1.6转基因阳性细胞的生物学特性在倒置显微镜下，观察转基因阳性细胞形态，并检测其细胞的生长特性；采用常规方法将转基因细胞进行冷冻复苏后，观察其细胞形态，并通过对其续培养观察其生长特点。
1.7转基因阳性细胞的PCR 鉴定分别提取山羊成纤维细胞和转STPpBC1的山羊成纤维细胞基因组，以ST1与ST2为特异性引物进行PCR 鉴定，检测2种细胞基因组中目的基因的整合情况。PCR 反应体系为25 μl，其中，基因组DNA 2.0 μl（100 ng），dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μl，10×rTaq Buffer 2.5 μl，ST1和ST2引物各1.0 μl，rTaq酶0.25 μl，水 17.25 μl。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，55.6 ℃30 s，72 ℃30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。
2结果与分析
2.1传代培养的山羊成纤维细胞形态利用山羊耳廓皮肤组织原代培养其成纤维细胞，在培养后的第3天，组织悬浮块周边出现梭形游离的细胞（图1），其细胞的核仁清晰，并开始逐渐贴壁，进入指数期；在培养后第7天，细胞贴壁生长达到80%～90%汇合；当将原代培养山羊成纤维细胞进行传代培养时，在培养后的第4天，细胞可达80%汇合（图2）。
图1原代培养的山羊成纤维细胞（100×）图2传代培养的山羊成纤维细胞（100×）2.2筛选轉基因阳性细胞的最适G418浓度采用“1.3”方法筛选最适G418浓度，结果表明，与添加其他浓度的G418相比，当添加G418的浓度为400 μg/ml时，第9天细胞全部死亡，以此确定G418的最适浓度为400 μg/ml（图3）。
图3筛选转基因细胞的最适G418浓度2.3转基因阳性细胞形态及其生长特性将线性化的STPpBC1转染山羊成纤维细胞并经G418筛选，对筛选的转基因进行续培养。在续培养后第3天，在倒置荧光显微镜下，其细胞能够呈现出与原代培养的山羊成纤维细胞相似的梭形，且核仁清晰；在续培养后的第7天，细胞间隔逐渐消失，呈梭形贴壁生长（图4）；转STPpBC1 的山羊成纤维细胞的培养生长曲线（图5） 显示，开始培养后的前3 d生长缓慢，且数量少于对照组，第4～6天细胞较快增殖，第7天后细胞数量变化趋于平缓，细胞生长曲线呈S形，符合细胞生长的生物学规律。
图4转基因山羊成纤维细胞细胞（100×）图5转基因细胞的生长曲线2.4经冷冻复苏的转基因阳性细胞形态及其生长特性将冷冻保存的转基因细胞，经复苏后进行续培养。在续培养后第24 h，细胞开始贴壁生长，其细胞形态呈梭形（图6）。经续培养后的第96 h，细胞达到约80%汇合；与未经冷冻的转基因细胞相似，经冷冻复苏的转基因阳性细胞曲线呈S形，符合细胞生长的生物学规律（图7）。
图6经冷冻复苏的转基因细胞图7经冷冻复苏的转基因细胞生长曲线2.5转基因细胞的PCR检测收集经转染STPpBC1，且利用含G418 的培养基筛选具有正常增殖能力的山羊成纤维细胞后，提取基因组DNA，并进行PCR 扩增。结果显示，2 处理组均可扩增出目的条带，与阳性对照（STPpBC1）扩增条带大小一致，阴性对照（正常山羊基因组DNA） 未扩增出条带（图8）。
注：1.阴性对照；2.D2000plus Marker；3、4.转基因细胞；5.阳性对照。
图8转基因细胞的PCR鉴定3讨论
目前，已发现具有甜味的主要蛋白有Miraculin[3]（存在于非洲西部植物Richadella dulcifera）、Curculin[4]（存在于仙矛植物）、Thaumatin[5]（存在于西非植物Thaumatococcus daniellii）、Monellin[6]（存在于热带植物Dioscoreophyllum cumminsii）、Mabinlin[7]（存在于我国云南植物Capparis masaikai）和Brazzein[8]（存在于西非野生的植物Pentadiplandra brazzeana），其中，由于Brazzein甜度高达相同质量蔗糖的2 000倍[9]而备受关注。
一般情况下，具有甜味蛋白的植物对其生长所需条件苛刻，且在其干物质中甜味蛋白的含量甚微[10]。为此，人们探索了采用转基因方法，通过马铃薯和烟草表达Thaumatin蛋白[11]，通过大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌[12]和毕赤酵母[13]表达Brazzein蛋白等方法，但未能获得理想的效果。
大量研究证实，选择组织特异性启动子与外源目的基因构建的真核表达载体并通过转基因方法能使外源基因在机体特异组织中表达。目前，利用乳腺细胞的特异性启动子和外源基因构建的表达载体，分别获得乳腺特异表达β-酪蛋白转基因小鼠[14]、表达α1antitrypsin（抗胰蛋白酶）的绵羊[15]等。此外，随着体细胞克隆技术的不断完善，体细胞克隆效率不断提高，获得体细胞克隆动物的种类和数量不断增加。自SCHNIEKE等[16]首次以转染外源DNA的绵羊成纤维细胞为核供体，通过细胞核移植方法成功获得了转基因绵羊以来，利用该方法已相继获得转基因牛[17]、猪[18]和山羊[19]。上述结果表明，将利用组织特异性启动子和外源基因构建的真核表达载体转染体细胞后，通过体细胞核移植方法，就能获得组织特异表达外源基因的转基因动物。 迄今为止尚未见到有关甜味蛋白基因在动物乳腺中表达的相关报道。为了建立甜味蛋白基因Brazzein在山羊乳腺中表达的方法，该研究利用前期工作中构建的山羊乳腺特异表达载体STPpB（Brazzein）C1，经线性化后转染传代培养的山羊成纤维细胞（图1、2），并通过最适G418浓度400 μg/ml（图3）进行转基因阳性细胞筛选，结果表明，获得细胞形态和生长曲线正常（图4、5）的转基因阳性细胞；经冷冻复苏后，转基因阳性细胞仍呈现正常形态和生长特性；PCR鉴定结果表明，STPpBC1已整合到转基因细胞的基因组中。上述结果表明，该研究成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株。能否利用该细胞通过体细胞核移植的方法获得乳腺特异表达甜味蛋白的转基因山羊有待于进一步探讨。
42卷24期王春生等转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选参考文献
[1] MING D，HELLEKANT G.Brazzein，a new high-potency thermostable sweet protein from PentadiplandrabrazzeanaB[J].FEBS Lett，1994，355（1）：106-108.
[2] 安辰瑞，李咏乐，詹丽楠，等.乳腺特异的甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体的构建[J].黑龙江畜牧兽医，2014（4）：29-32.
[3] KURIHARA K，BEIDLER M.Tastemodifying protein from Miracle fruit[J].Science，1968，161：1241-1243.
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[5] CORNELISSEN B J，HOOFT VAN HUIJSDUIJNEN R A，BOL J F，et al.A tobacco mosaic virusinduced tobacco protein is homologous to the sweettasting protein thaumatin[J].Nature，1986 ，321（6069）：531-532.
[6] MORRIS J A，CAGAN R H.Purification of monellin the sweet principal for Dioscoreophyllumcumminsii[J].Biochim Biophys，1972，261：114-122.
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[8] CALDWELL J E，ABILDGAARD F，DZAKULA Z，et al.Solution structure of the thermostable sweettasting proteinbrazzein[J].Nat Struct Biol，1998，5：427-431.
[9] IZAWA H，OTA M，KOHMURA M，et al.Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein[J].Biopolymers，1996，39（1）：95-101.
[10] HELLEKANT G，DANILOVA V.Brazzein a small，sweet protein：discovery and physiological overview[J].Chem Senses，2005，30（1）：88-89.
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[18] HAO Y H，YONG H Y，MURPHY C N，et al.Production of endothelial nitric oxide synthase （eNOS） over-expressing piglets[J].Transgenic Research，2006，15：739-750.
[19] LIU F J，ZHANG Y L，YANG Z J，et al.Pregnancies resulting from transgenic embryos with human lactoferringeneproduced by somatic cell nuclear transfer[J].Agricultural Science&Technology，2008，9（4）：87-91.
关键词山羊；乳腺特异表达载体；Brazzein基因；转基因细胞
中图分类号S827文献标识码A文章编号0517-6611（2014）24-08099-03
The Screening and Identification of Transgenic Goat Fibroblast Cells with Sweet Protein Brazzein Gene
WANG Chunsheng， AN Tiezhu et al （College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）
Abstract [Objective] In order to obtain transgenic goat fibroblast cells with sweet protein Brazzein gene. [Method] Goat fibroblast cells were transfected with mammary gland specific expression vector STPpBC1 constructed in the previous work by cationic liposome method and cultured G418resistant cell. After PCR identified， transgenic cell line with Tem was established. The G418 positive cells were detected. [Result] Transgenic cell could be obtained by the optimum concentration of G418. Morphology of the transgenic cell and transgenic cells after freezingthawing was similar with normal mammary epithelial cells， the cell growth curve was “S” shape， PCR results showed that the vector constructed was integrated into genome. [Conclusion] The transgenic cells with temporinGFP were filtrated， and lay the foundation for the transgenic goat with expression temporin in mammary.
Key words Goat； Mammary gland specific expression vector； Brazzein gene； Transgenic cell
甜味蛋白Brazzein是西非野生植物Pentadiplandra brazzeana外果皮和種子之间形成的一种蛋白，具有极高的与糖类相似甜味，但其含量仅为果实干重的0.02%～005%[1]。因此，通过植物难以获得大量的Brazzein蛋白。如果采用转基因的方法，就能通过动物等生物反应器获取大量的Brazzein蛋白。为了通过山羊乳汁获取Brazzein蛋白，笔者利用前期工作[2]中构建的山羊乳腺特异Brazzein基因真核表达转染山羊成纤维细胞，以期获得转Brazzein基因阳性细胞株，为建立通过体细胞移植方法培育乳腺特异表达Brazzein的山羊奠定基础。
1材料与方法
1.1山羊皮肤成纤维细胞的培养采取约10日龄幼山羊耳廓皮肤组织，采用常规方法，用CO2培养箱（38 ℃、5%CO2、100%湿度），以DMEM（含10%胎牛血清）培养液原代培养山羊皮肤成纤维细胞，并进行3～4代的传代培养。
1.2最适G418浓度的筛选用分别含有1 000、800、600、400、200、100 和50 μg/μl G418 的DMEM（含10%胎牛血清）培养液培养“1.1”中传代培养的山羊皮肤成纤维细胞，根据细胞存活状态，确定筛选阳性细胞的最佳G418浓度。
1.3Brazzein基因真核表达载体的线性化在前期工作[2]中已获得山羊乳腺特异表达Brazzein基因的真核表达载体，即根据GenBank中甜味蛋白Brazzein基因的mRNA序列（A95587），人工合成Brazzein基因pUC57质粒（命名为STpUC57）；以ST pUC57质粒作为模板，TP1（5′GTCGACATGGCTAAGTTTGCTTCT3′）和TP2（5′GTCGACTTAGTATTCGCAGTAATC3′）为引物，利用rTaq DNA Polymerase进行梯度PCR扩增，对目的条带进行胶回收，并连接到pMD18Simple载体上，获得被命名为STPpMD18Simple的表达载体；利用Sal1酶对STPpMD18Simple进行单酶双酶切，并用Gel Extraction Kit胶回收试剂盒进行胶回收，获得甜味蛋白Brazzein基因片段；用Xho1酶单酶切乳腺特性载体pBC1获得线性化乳腺特性载体pBC1载体；Brazzein基因和线性化的山羊乳腺特异性pBC1载体进行连接转化后，获得乳腺特异的Brazzein基因真核表达载体（命名为STPpBC1）。将STPpBC1利用NotI酶进行单酶切后进行线性化。 1.4山羊皮肤成纤维细胞的转染将“1.1”中传代培养的山羊成纤维细胞，用无抗生素的DMEM（含10%胎牛血清）培养液进行培养，当细胞达到60%～70%后，根据脂质体Lipofect Transfect Reagen（Tiangen）说明，用上述线性化的STPpBC1进行转染。
1.5转基因阳性细胞的筛选将“1.4”中用线性化STPpBC1转染的山羊成纤维细胞，在含有“1.3”中筛选的G418 浓度的DMEM（ 含10%胎牛血清） 溶液中培养，在倒置显微镜下，每隔24 h 观察细胞形态和存活状态，当未转染细胞全部死亡后，再用含G418 的培养液继续筛选7 d，最后用无G418 的培养液传代培养，观察计算并绘制细胞生长曲线（ 每个时间点设3个重复）。
1.6转基因阳性细胞的生物学特性在倒置显微镜下，观察转基因阳性细胞形态，并检测其细胞的生长特性；采用常规方法将转基因细胞进行冷冻复苏后，观察其细胞形态，并通过对其续培养观察其生长特点。
1.7转基因阳性细胞的PCR 鉴定分别提取山羊成纤维细胞和转STPpBC1的山羊成纤维细胞基因组，以ST1与ST2为特异性引物进行PCR 鉴定，检测2种细胞基因组中目的基因的整合情况。PCR 反应体系为25 μl，其中，基因组DNA 2.0 μl（100 ng），dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μl，10×rTaq Buffer 2.5 μl，ST1和ST2引物各1.0 μl，rTaq酶0.25 μl，水 17.25 μl。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，55.6 ℃30 s，72 ℃30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。
2结果与分析
2.1传代培养的山羊成纤维细胞形态利用山羊耳廓皮肤组织原代培养其成纤维细胞，在培养后的第3天，组织悬浮块周边出现梭形游离的细胞（图1），其细胞的核仁清晰，并开始逐渐贴壁，进入指数期；在培养后第7天，细胞贴壁生长达到80%～90%汇合；当将原代培养山羊成纤维细胞进行传代培养时，在培养后的第4天，细胞可达80%汇合（图2）。
图1原代培养的山羊成纤维细胞（100×）图2传代培养的山羊成纤维细胞（100×）2.2筛选轉基因阳性细胞的最适G418浓度采用“1.3”方法筛选最适G418浓度，结果表明，与添加其他浓度的G418相比，当添加G418的浓度为400 μg/ml时，第9天细胞全部死亡，以此确定G418的最适浓度为400 μg/ml（图3）。
图3筛选转基因细胞的最适G418浓度2.3转基因阳性细胞形态及其生长特性将线性化的STPpBC1转染山羊成纤维细胞并经G418筛选，对筛选的转基因进行续培养。在续培养后第3天，在倒置荧光显微镜下，其细胞能够呈现出与原代培养的山羊成纤维细胞相似的梭形，且核仁清晰；在续培养后的第7天，细胞间隔逐渐消失，呈梭形贴壁生长（图4）；转STPpBC1 的山羊成纤维细胞的培养生长曲线（图5） 显示，开始培养后的前3 d生长缓慢，且数量少于对照组，第4～6天细胞较快增殖，第7天后细胞数量变化趋于平缓，细胞生长曲线呈S形，符合细胞生长的生物学规律。
图4转基因山羊成纤维细胞细胞（100×）图5转基因细胞的生长曲线2.4经冷冻复苏的转基因阳性细胞形态及其生长特性将冷冻保存的转基因细胞，经复苏后进行续培养。在续培养后第24 h，细胞开始贴壁生长，其细胞形态呈梭形（图6）。经续培养后的第96 h，细胞达到约80%汇合；与未经冷冻的转基因细胞相似，经冷冻复苏的转基因阳性细胞曲线呈S形，符合细胞生长的生物学规律（图7）。
图6经冷冻复苏的转基因细胞图7经冷冻复苏的转基因细胞生长曲线2.5转基因细胞的PCR检测收集经转染STPpBC1，且利用含G418 的培养基筛选具有正常增殖能力的山羊成纤维细胞后，提取基因组DNA，并进行PCR 扩增。结果显示，2 处理组均可扩增出目的条带，与阳性对照（STPpBC1）扩增条带大小一致，阴性对照（正常山羊基因组DNA） 未扩增出条带（图8）。
注：1.阴性对照；2.D2000plus Marker；3、4.转基因细胞；5.阳性对照。
图8转基因细胞的PCR鉴定3讨论
目前，已发现具有甜味的主要蛋白有Miraculin[3]（存在于非洲西部植物Richadella dulcifera）、Curculin[4]（存在于仙矛植物）、Thaumatin[5]（存在于西非植物Thaumatococcus daniellii）、Monellin[6]（存在于热带植物Dioscoreophyllum cumminsii）、Mabinlin[7]（存在于我国云南植物Capparis masaikai）和Brazzein[8]（存在于西非野生的植物Pentadiplandra brazzeana），其中，由于Brazzein甜度高达相同质量蔗糖的2 000倍[9]而备受关注。
一般情况下，具有甜味蛋白的植物对其生长所需条件苛刻，且在其干物质中甜味蛋白的含量甚微[10]。为此，人们探索了采用转基因方法，通过马铃薯和烟草表达Thaumatin蛋白[11]，通过大肠杆菌以及枯草芽孢杆菌[12]和毕赤酵母[13]表达Brazzein蛋白等方法，但未能获得理想的效果。
大量研究证实，选择组织特异性启动子与外源目的基因构建的真核表达载体并通过转基因方法能使外源基因在机体特异组织中表达。目前，利用乳腺细胞的特异性启动子和外源基因构建的表达载体，分别获得乳腺特异表达β-酪蛋白转基因小鼠[14]、表达α1antitrypsin（抗胰蛋白酶）的绵羊[15]等。此外，随着体细胞克隆技术的不断完善，体细胞克隆效率不断提高，获得体细胞克隆动物的种类和数量不断增加。自SCHNIEKE等[16]首次以转染外源DNA的绵羊成纤维细胞为核供体，通过细胞核移植方法成功获得了转基因绵羊以来，利用该方法已相继获得转基因牛[17]、猪[18]和山羊[19]。上述结果表明，将利用组织特异性启动子和外源基因构建的真核表达载体转染体细胞后，通过体细胞核移植方法，就能获得组织特异表达外源基因的转基因动物。 迄今为止尚未见到有关甜味蛋白基因在动物乳腺中表达的相关报道。为了建立甜味蛋白基因Brazzein在山羊乳腺中表达的方法，该研究利用前期工作中构建的山羊乳腺特异表达载体STPpB（Brazzein）C1，经线性化后转染传代培养的山羊成纤维细胞（图1、2），并通过最适G418浓度400 μg/ml（图3）进行转基因阳性细胞筛选，结果表明，获得细胞形态和生长曲线正常（图4、5）的转基因阳性细胞；经冷冻复苏后，转基因阳性细胞仍呈现正常形态和生长特性；PCR鉴定结果表明，STPpBC1已整合到转基因细胞的基因组中。上述结果表明，该研究成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株。能否利用该细胞通过体细胞核移植的方法获得乳腺特异表达甜味蛋白的转基因山羊有待于进一步探讨。
42卷24期王春生等转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选参考文献
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