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[摘要] 目的 建立葛根芩连汤中盐酸小檗碱的定性定量分析方法，为从事该方的研究及其他含黄连方剂的开发提供参考。 方法 采用薄层色谱对新药中的黄连进行了鉴别，并用高效液相色谱法测定了葛根芩连汤中黄连的指标性成分鹽酸小檗碱的含量。 结果 高效液相色潽法操作简单、结果准确，可以作为葛根芩连汤中盐酸小檗碱的定性定量分析方法。 结论 该套方法简单、结果准确，可以作为葛根芩连汤中盐酸小檗碱的定性定量分析方法，同时为其他含黄连方剂的研究提供参考。
[关键词] 葛根芩连汤；盐酸小檗碱；薄层色谱；高效液相色谱
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2011）23-43-02
Berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction of qualitative and quantitative analysis
REN Jiansheng DAI Kaijin XU Dapeng
Department of Medicine and Apparatus,No. 201 Hospital of PLA,Liaoyang 111000,China
[Abstract] Objective To establishment of berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction methods of qualitative and quantitative analysis,involved in the development of research and other Berberine-containing prescription provide a reference. Methods Using thin-layer chromatographic identification of coptis chinensis on new drugs,and by high performance liquid chromatographic determination of Berberine in gegenqinlian decoction of content of Berberine hydrochloride of index constituents. Results The method was simple,accurate results could be regarded as Berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction methods of qualitative and quantitative analysis. Conclusion The method was simple,accurate results can be regarded as Berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction methods of qualitative and quantitative analysis,while for other Berberine-containing prescription research with reference.
[Key words] Gegenqinlian decoction;Berberine hydrochloride;TLC;HPLC
葛根芩连汤由葛根、黄连、黄芩、甘草四味药组成，为医圣张仲景名方，出自《伤寒论·太阳篇》，有解表清里、升清止利之功，经过长期临床应用，疗效卓越，并由此而衍生出各种剂型。其中黄连所含盐酸小檗碱、黄连碱等生物碱类成分是其主要药效成分[1]，常常选择其作为定性或定量的依据，但尚缺乏系统的质量控制标准。为此，本研究对葛根芩连汤中盐酸小檗碱进行了定性、定量分析，为从事该方的研究及其他含黄连方剂的开发提供参考。
1 仪器及试药
CS-930薄层色谱扫描仪，美国惠普HP-1100高效液相色谱仪（检测器：G1315A紫外-可见光二级管阵列检测器）；甲醇（色谱纯-美国Fisher公司），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾（分析纯），三乙胺（分析纯），乙酸胺（分析纯），硅胶G，其他试剂均为分析纯；对照品：盐酸小檗碱（中国药品生物制品检定所，07139904）；葛根、黄芩、黄连、甘草药材由广州市药材公司提供并鉴定。
2 实验方法及结果
2.1 黄连的薄层色谱鉴别
2.1.1 供试样品的制备 葛根芩连汤取葛根、黄芩、黄连和甘草各味药材1剂，煎煮2次，第1次加水8倍药材量、煎1 h，第3次加水4倍药材量、煎0.5 h，脱脂棉抽滤，合并滤液，减压浓缩，沸水浴蒸干，研细，精密称取约0.2 g，90 mL乙醇超声1 h，过滤、乙醇洗涤，定容100 mL，作为供试液；阴性样品同法制备；称取黄连粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超声提取10 min，滤过，滤液浓缩至干，甲醇定容5 mL，制成黄连阳性对照液；另取盐酸小檗碱对照品加乙醇制成１mg/mL的溶液。
2.1.2 薄层鉴别 分别取供试液、阴性对照液、黄连阳性对照液、盐酸小檗碱溶液等点于同一硅胶Ｇ板上，以苯-乙酸乙脂-甲醇-异丙醇-浓氨水（12∶6∶3∶3∶1）为展开剂，展开，展距约为18 cm。取出，晾干，置紫外365 nm下检视。结果见图1。该药在黄连阳性对照、盐酸小檗碱的相应位置有斑点，阴性对照则无，薄层效果良好。
1.黄连 2.缺黄连 3.葛根芩连汤 4.盐酸小檗碱
图1 黄连的薄层鉴别
2.2 HPLC法测定葛根芩连汤中盐酸小檗碱的含量
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Zntersil ODS-（4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈-0.2 mol/L乙酸胺（0.01 mol/L KH2PO4 + 0.2%三乙胺）（47∶53）；流速：0.8 mL/min；柱温：室温；检测波长：346 nm。
2.2.2 标准曲线 精密称取盐酸小檗碱对照品6.06 mg，置50 mL容量瓶中，加80 mL甲醇溶解，加水至100 mL制成标准品溶液。精确吸取标准溶液1、2、4、6、8于10 mL量瓶中，甲醇定容。各精密吸取5 μL进样，测得峰面积，以浓度（μg/mL）对峰面积进行线性回归，得回归方程：Y=19.568 972 3X-9.564 875，r=0.999 9。结果表明盐酸小檗碱在12.12~96.96 μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.2.3 精密度实验 取标准溶液重复进样5次，每次5 μL，精密度为（98.00±0.85）%，RSD为0.16%，精密度较好。
2.2.4 稳定性考察 取盐酸小檗碱对照品和样品液各1份，在1 d内4个不同时间进样5 μL，测定浓度，稳定性良好。见表1。
2.2.5 加样回收率实验 精密量取葛根芩连水提物1 mL 8份，在其中4份中加入盐酸小檗碱对照品约6 mg，以甲醇30 mL，超声提取过滤，洗涤，转移至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，进样5 μL，测得浓度，计算含量，求得平均回收率为98.50%（n=4），RSD=0.59%。见表2。
2.2.6 供试液的制备及含量测定 按处方配比取葛根芩连汤各味药饮片3份及缺黄连阴性1份，加水400 mL，先煎葛根20 mim，余药共煎30 min，煎2次，合并，90℃热定容1 000 mL，取5 mL，用90 mL甲醇超声提取1 h ，过滤，洗涤，用甲醇定容至100 mL，膜过滤，进样 （每个样品进样3次），测得浓度，计算含量。见表3。样品及阴性样色谱图见图2。
2.2.7 结论 采用甲醇分别回流提取、超声提取0.5、1、3 h，结果表明，超声1 h，提取完全，本提取方法省时、简单。3批样品
1.盐酸小檗碱标准品 2.样品-1 3.样品-2
4.样品-3 5.阴性对照（缺黄连）
测定结果表明该法结果准确，重现性好，并为其他含盐酸小檗碱的制剂中该成分的测定提供参考。
3 讨论
生物碱（alkaloid）是一类含氮的碱性天然化合物，大多具有复杂的环状结构，极性较小，易溶于有机溶剂，几乎不溶于水，成盐后水溶性增加。但黄连中小檗碱盐酸盐等生物碱盐难溶于水，易溶于热水和乙醇，常常采用水、酸水或醇类溶剂提取，而且水提要趁热过滤，减少损失。生物碱的定性鉴别主要有沉淀反应、显色反应和色谱鉴别，其中又以色谱鉴别最为常用，灵敏度高，常用薄层色谱、纸色谱、高效液相色谱和气相色谱鉴别中药制剂中生物碱类成分。如夏延任等[2]采用薄层色谱法，对葛根芩连片中的黄连进行了鉴别，效果良好。
生物碱定量的方法较多，早期常采用酸碱滴定法、沉淀法、酸性染料比色法、雷氏盐比色法等；近年来多采用分光光度法、薄层扫描定量法、高效液相色谱法和气相色谱法等。如王春明等[3]采用HPLC法测定了静灵口服液中盐酸小檗碱的含量；李宝明等[4]用高效液相色谱法对制霉灭滴胶囊中的盐酸小檗碱含量作了测定。本实验采用薄层色谱，以苯-乙酸乙脂-甲醇-异丙醇-浓氨水（12∶6∶3∶3∶1）为展开剂对葛根芩连汤中的黄连进行了鉴别，效果良好。
本研究用高效液相色谱法测定葛根芩连汤中黄连的指標性成分盐酸小檗碱的含量，并且比较了回流提取和超声提取，以超声提取1 h为佳，建立葛根芩连汤中盐酸小檗碱的定性定量分析方法。结果准确，方法简便，灵敏度高，精密度、稳定性、回收率均达到定量分析的标准。可以作为葛根芩连汤及其制剂中盐酸小檗碱的定性定量分析方法，同时为其他含黄连方剂的研究提供了参考。
[参考文献]
[1] 李建祥，刘立干.黄连药理作用临床评述[J].时珍国医国药，1999，10（10）：797.
[2] 夏延任，杨新春.葛根芩连片质量标准的研究[J].湖南中医药导报，2000，6（8）：38-40.
[3] 王春明，许丽杰，黄庆柏，等.HPLC法测定静灵口服液中盐酸小檗碱的含量[J].药物分析杂志，1995，15（4）：38-39.
[4] 李宝明，何丽一.高效液相色谱法测定制霉灭滴胶囊中盐酸小檗碱的含量[J].药物分析杂志，2000，20（20）：128-129.
（收稿日期：2011-11-08）
[关键词] 葛根芩连汤；盐酸小檗碱；薄层色谱；高效液相色谱
[中图分类号] R284 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2011）23-43-02
Berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction of qualitative and quantitative analysis
REN Jiansheng DAI Kaijin XU Dapeng
Department of Medicine and Apparatus,No. 201 Hospital of PLA,Liaoyang 111000,China
[Abstract] Objective To establishment of berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction methods of qualitative and quantitative analysis,involved in the development of research and other Berberine-containing prescription provide a reference. Methods Using thin-layer chromatographic identification of coptis chinensis on new drugs,and by high performance liquid chromatographic determination of Berberine in gegenqinlian decoction of content of Berberine hydrochloride of index constituents. Results The method was simple,accurate results could be regarded as Berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction methods of qualitative and quantitative analysis. Conclusion The method was simple,accurate results can be regarded as Berberine hydrochloride in gegenqinlian decoction methods of qualitative and quantitative analysis,while for other Berberine-containing prescription research with reference.
[Key words] Gegenqinlian decoction;Berberine hydrochloride;TLC;HPLC
葛根芩连汤由葛根、黄连、黄芩、甘草四味药组成，为医圣张仲景名方，出自《伤寒论·太阳篇》，有解表清里、升清止利之功，经过长期临床应用，疗效卓越，并由此而衍生出各种剂型。其中黄连所含盐酸小檗碱、黄连碱等生物碱类成分是其主要药效成分[1]，常常选择其作为定性或定量的依据，但尚缺乏系统的质量控制标准。为此，本研究对葛根芩连汤中盐酸小檗碱进行了定性、定量分析，为从事该方的研究及其他含黄连方剂的开发提供参考。
1 仪器及试药
CS-930薄层色谱扫描仪，美国惠普HP-1100高效液相色谱仪（检测器：G1315A紫外-可见光二级管阵列检测器）；甲醇（色谱纯-美国Fisher公司），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾（分析纯），三乙胺（分析纯），乙酸胺（分析纯），硅胶G，其他试剂均为分析纯；对照品：盐酸小檗碱（中国药品生物制品检定所，07139904）；葛根、黄芩、黄连、甘草药材由广州市药材公司提供并鉴定。
2 实验方法及结果
2.1 黄连的薄层色谱鉴别
2.1.1 供试样品的制备 葛根芩连汤取葛根、黄芩、黄连和甘草各味药材1剂，煎煮2次，第1次加水8倍药材量、煎1 h，第3次加水4倍药材量、煎0.5 h，脱脂棉抽滤，合并滤液，减压浓缩，沸水浴蒸干，研细，精密称取约0.2 g，90 mL乙醇超声1 h，过滤、乙醇洗涤，定容100 mL，作为供试液；阴性样品同法制备；称取黄连粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超声提取10 min，滤过，滤液浓缩至干，甲醇定容5 mL，制成黄连阳性对照液；另取盐酸小檗碱对照品加乙醇制成１mg/mL的溶液。
2.1.2 薄层鉴别 分别取供试液、阴性对照液、黄连阳性对照液、盐酸小檗碱溶液等点于同一硅胶Ｇ板上，以苯-乙酸乙脂-甲醇-异丙醇-浓氨水（12∶6∶3∶3∶1）为展开剂，展开，展距约为18 cm。取出，晾干，置紫外365 nm下检视。结果见图1。该药在黄连阳性对照、盐酸小檗碱的相应位置有斑点，阴性对照则无，薄层效果良好。
1.黄连 2.缺黄连 3.葛根芩连汤 4.盐酸小檗碱
图1 黄连的薄层鉴别
2.2 HPLC法测定葛根芩连汤中盐酸小檗碱的含量
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Zntersil ODS-（4.6 mm×150 mm）；流动相：乙腈-0.2 mol/L乙酸胺（0.01 mol/L KH2PO4 + 0.2%三乙胺）（47∶53）；流速：0.8 mL/min；柱温：室温；检测波长：346 nm。
2.2.2 标准曲线 精密称取盐酸小檗碱对照品6.06 mg，置50 mL容量瓶中，加80 mL甲醇溶解，加水至100 mL制成标准品溶液。精确吸取标准溶液1、2、4、6、8于10 mL量瓶中，甲醇定容。各精密吸取5 μL进样，测得峰面积，以浓度（μg/mL）对峰面积进行线性回归，得回归方程：Y=19.568 972 3X-9.564 875，r=0.999 9。结果表明盐酸小檗碱在12.12~96.96 μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.2.3 精密度实验 取标准溶液重复进样5次，每次5 μL，精密度为（98.00±0.85）%，RSD为0.16%，精密度较好。
2.2.4 稳定性考察 取盐酸小檗碱对照品和样品液各1份，在1 d内4个不同时间进样5 μL，测定浓度，稳定性良好。见表1。
2.2.5 加样回收率实验 精密量取葛根芩连水提物1 mL 8份，在其中4份中加入盐酸小檗碱对照品约6 mg，以甲醇30 mL，超声提取过滤，洗涤，转移至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，进样5 μL，测得浓度，计算含量，求得平均回收率为98.50%（n=4），RSD=0.59%。见表2。
2.2.6 供试液的制备及含量测定 按处方配比取葛根芩连汤各味药饮片3份及缺黄连阴性1份，加水400 mL，先煎葛根20 mim，余药共煎30 min，煎2次，合并，90℃热定容1 000 mL，取5 mL，用90 mL甲醇超声提取1 h ，过滤，洗涤，用甲醇定容至100 mL，膜过滤，进样 （每个样品进样3次），测得浓度，计算含量。见表3。样品及阴性样色谱图见图2。
2.2.7 结论 采用甲醇分别回流提取、超声提取0.5、1、3 h，结果表明，超声1 h，提取完全，本提取方法省时、简单。3批样品
1.盐酸小檗碱标准品 2.样品-1 3.样品-2
4.样品-3 5.阴性对照（缺黄连）
测定结果表明该法结果准确，重现性好，并为其他含盐酸小檗碱的制剂中该成分的测定提供参考。
3 讨论
生物碱（alkaloid）是一类含氮的碱性天然化合物，大多具有复杂的环状结构，极性较小，易溶于有机溶剂，几乎不溶于水，成盐后水溶性增加。但黄连中小檗碱盐酸盐等生物碱盐难溶于水，易溶于热水和乙醇，常常采用水、酸水或醇类溶剂提取，而且水提要趁热过滤，减少损失。生物碱的定性鉴别主要有沉淀反应、显色反应和色谱鉴别，其中又以色谱鉴别最为常用，灵敏度高，常用薄层色谱、纸色谱、高效液相色谱和气相色谱鉴别中药制剂中生物碱类成分。如夏延任等[2]采用薄层色谱法，对葛根芩连片中的黄连进行了鉴别，效果良好。
生物碱定量的方法较多，早期常采用酸碱滴定法、沉淀法、酸性染料比色法、雷氏盐比色法等；近年来多采用分光光度法、薄层扫描定量法、高效液相色谱法和气相色谱法等。如王春明等[3]采用HPLC法测定了静灵口服液中盐酸小檗碱的含量；李宝明等[4]用高效液相色谱法对制霉灭滴胶囊中的盐酸小檗碱含量作了测定。本实验采用薄层色谱，以苯-乙酸乙脂-甲醇-异丙醇-浓氨水（12∶6∶3∶3∶1）为展开剂对葛根芩连汤中的黄连进行了鉴别，效果良好。
本研究用高效液相色谱法测定葛根芩连汤中黄连的指標性成分盐酸小檗碱的含量，并且比较了回流提取和超声提取，以超声提取1 h为佳，建立葛根芩连汤中盐酸小檗碱的定性定量分析方法。结果准确，方法简便，灵敏度高，精密度、稳定性、回收率均达到定量分析的标准。可以作为葛根芩连汤及其制剂中盐酸小檗碱的定性定量分析方法，同时为其他含黄连方剂的研究提供了参考。
[参考文献]
[1] 李建祥，刘立干.黄连药理作用临床评述[J].时珍国医国药，1999，10（10）：797.
[2] 夏延任，杨新春.葛根芩连片质量标准的研究[J].湖南中医药导报，2000，6（8）：38-40.
[3] 王春明，许丽杰，黄庆柏，等.HPLC法测定静灵口服液中盐酸小檗碱的含量[J].药物分析杂志，1995，15（4）：38-39.
[4] 李宝明，何丽一.高效液相色谱法测定制霉灭滴胶囊中盐酸小檗碱的含量[J].药物分析杂志，2000，20（20）：128-129.
（收稿日期：2011-11-08）