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轮状病毒（Rotavirus,RV）广泛存在于世界范围,是导致幼龄动物和人类腹泻的主要病原之一,对养殖业和人类的健康危害很大。益生菌及其代谢产物作为维护肠道健康的重要成分,具有抑制RV感染的能力,并且在维持肠上皮细胞间的紧密连接、肠组织屏障稳定、保护肠粘膜中发挥重要的作用。为探究干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）对A组OSU株猪轮状病毒感染猪肠上皮IPEC-J2细胞和昆明乳鼠小肠屏障的形态与功能影响及相关机制,本研究从体外细胞水平与乳鼠体内水平上探索益生菌对RV感染的干预或拮抗作用。体外试验以IPEC-J2细胞为平台,探究了干酪乳杆菌预处理和后处理抑制RV感染细胞的某些调节效应和机制。实验选择干酪乳杆菌6 h分泌的蛋白利用分子筛进行分段（<3 KD、3-10 KD、10-50 KD、>50 KD和总蛋白）,根据分泌蛋白与RV作用的先后将实验分为蛋白预处理组、后处理组与共处理组,并根据实验结果选取出抑制RV效果最佳分子量段的分泌蛋白。实时荧光定量PCR（q PCR）试验检测各分组:空白对照组、轮状病毒组（RV组）、预处理组、后处理组、共处理组,收集各组0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h的细胞样品,检测细胞紧密连接蛋白occludin、claudin-1的m RNA的变化情况。体内试验以2日龄昆明乳鼠为实验动物,试验分为五组:空白对照组（简称对照组）、益生菌组、轮状病毒组（RV组）、预防组、治疗组,每只乳鼠饲喂干酪乳杆菌50μL,毒力为10-5.28TCID50/0.1 m L猪轮状病毒50μL,在第1 d、2 d、3 d、4 d、6 d、8 d、10 d天取各组乳鼠空肠组织样品,通过ELISA、石蜡切片HE染色、免疫组化、冰冻切片间接免疫荧光、q PCR等技术,对乳鼠体重、粪便中RV含量、空肠绒毛组织变化、紧密连接蛋白的表达、SIg A含量分布等指标进行检测,阐述益生菌对感染RV前后小肠组织的调控作用。一、体外试验部分1.干酪乳杆菌分泌蛋白作用IPEC-J2细胞能降低RV的感染。从处理方式来看,抑制病毒效果:预处理组>共处理组>后处理组（P<0.05）。从分子量段来看,<3 KD、3-10 KD、10-50 KD、>50 KD和总蛋白,这5种分子量段分泌蛋白作用细胞后均有一定抑制RV的作用,其中分子质量<3 KD的分泌蛋白抑制RV感染力的作用最强（P<0.05）,>50 KD效果不显著（P>0.05）。2.紧密连接蛋白occludin、claudin-1实时荧光定量PCR结果表明:RV组occludin m RNA相对表达量12 h开始逐渐下降,60 h降到最低后稳定;从24 h开始显著低于对照组、预处理组（P<0.05）;在24 h、48 h、60 h显著低于共处理组（P<0.05）,其余时间差异不显著（P>0.05）;与后处理组相比各时间段差异不显著（P>0.05）。后处理组claudin-1 m RNA相对表达量从24h开始显著低于对照组（P<0.05）;在24 h、60 h显著低于共处理组（P<0.05）,其余时间差异不显著（P>0.05）;在12 h、24 h、48 h、60 h显著低于预处理组（P<0.05）,其余时间差异不显著（P>0.05）。claudin-1 m RNA变化结果表明,RV组在攻毒12 h开始claudin-1 m RNA相对表达量逐渐下降,60 h降到最低后稳定;RV组从24 h开始显著低于对照组（P<0.05）,从12 h开始显著低于预处理组（P<0.05）,从36 h开始显著低于共处理组（P<0.05）。后处理组在12 h claudin-1 m RNA相对表达量低于RV组（P>0.05）,在24 h、36 h、48 h、60 h、72 h高于RV组（P>0.05）,12 h、36 h、48 h、60 h、72 h显著低于对照组（P<0.05）,在12 h、48 h、60 h、72 h显著低于预处理组（P<0.05）,在48 h低于共处理组（P<0.05）,其余时间差异不显著（P<0.05）。二、乳鼠体内试验部分1.干酪乳杆菌对RV感染乳鼠后的相关效应:干酪乳杆菌可缓解乳鼠感染RV后体重降低的情况,1-4 d时各组乳鼠体重差异不显著（P>0.05）,在5-10 d时益生菌组显著高于其他组（P<0.05）,对照组、预防组乳鼠体重显著高于RV组（P<0.05）。乳鼠粪便RV酶联免疫分析检测显示,RV组和治疗组病毒含量呈波状变化,预防组病毒含量在攻毒后1d最高,随后下降;预防组、治疗组从3 d开始病毒含量显著低于RV组（P<0.05）。空肠石蜡切片显示攻毒后3 d,RV组乳鼠空肠绒毛排列紊乱、缩短脱落、内部组织缺失,上皮细胞出现空泡样变性等明显病理变化,预防组、治疗组的肠绒毛损伤等情况与病毒组相比均显著改善。通过测量各组空肠绒毛长度可知,对照组、生菌组和预防组1 d、3 d、5 d绒毛长度差异不显著（P>0.05）,RV组绒毛长度在1 d、3 d时和治疗组相比差异不显著（P>0.05）,5 d时显著低于治疗组（P<0.05）,RV组与其他各组各时间段相比差异显著（P<0.05）;治疗组1 d、3 d时绒毛长度低于对照组（P<0.05）,5 d时差异不显著（P>0.05）。对攻毒后3 d乳鼠空肠进行冰冻切片间接免疫荧光,结果显示RV组绿色荧光最暗,SIg A含量最低;益生菌组小肠壁SIg A含量分布最多,显著高于RV组（P<0.05）,预防组、治疗组的SIg A分布及含量较RV组也有显著增加。2.肠组织紧密连接蛋白occludin、claudin-1的表达:实时荧光定量PCR结果显示:攻毒前对照组和益生菌组occludin、claudin-1m RNA相对表达量差异不显著（P>0.05）;攻毒后益生菌组6 d、8 d、10 d时occludin、claudin-1m RNA相对表达量均显著高于RV组（P<0.05）,治疗组和预防组occludin m RNA相对表达量在6 d、8 d略高于RV组（P>0.05）,10 d时显著高于RV组（P<0.05）;治疗组和预防组claudin-1m RNA相对表达量在6 d、8 d、10 d高于RV组（P>0.05）。免疫组化结果表明:紧密连接蛋白occludin、claudin-1的棕黄色粗颗粒主要分布在肠绒毛边缘上皮细胞膜外侧和,少量分布在细胞质内。occludin检测结果为益生菌组、对照组、预防组的平均光密度显著高于RV组（P<0.05）;益生菌组的光密度值最高,显著高于对照组（P<0.05）;预防组光密度略大于治疗组,差异不显著（P>0.05）;治疗组光密度略大于RV组,差异不显著（P>0.05）。claudin-1检测结果为RV组的平均光密度显著低于其他各组（P<0.05）,益生菌组平均光密度显著高于其他各组（P<0.05）;治疗组的光密度值低于对照组（P<0.05）;治疗组和预防组的光密度值差异不显著（P>0.05）。综上所述,干酪乳杆菌可抑制RV感染IPEC-J2细胞,用分子质量小于3 KD的分泌蛋白采用预处理方式抑制RV感染IPEC-J2细胞效果最佳;促进紧密连接蛋白occludin、claudin-1的m RNA表达来增强细胞的完整性。乳鼠在感染RV后饲喂干酪乳杆菌,可改善乳鼠体重增长率,降低乳鼠粪便中RV含量;对RV感染受损伤的肠绒毛保护和修复,显著增加RV感染的乳鼠肠道粘膜分泌SIg A,促进乳鼠空肠中紧密连接蛋白occludin、claudin-1的表达等方式,保护肠组织细胞的屏障稳态。