第一部分肠道菌群在急性髓性白血病中的变化及对疾病进展的调控作用研究研究背景急性髓性白血病（AML）是一种以未成熟髓系细胞过度增殖为特征的血液系统恶性肿瘤。虽然目前化疗对AML有效,但患者的长期存活率并不高。AML的长期生存和预后与AML进展过程中的诸多影响因素密切相关。因此,更好地了解AML进展机制,对改善AML预后和生存具有重要的意义。人体肠道内寄居着大量种类繁多的细菌,总称为肠道菌群。正常情况下,肠道菌群内,各种细菌间按一定比例组合,互相制约,互相依存,在质和量上形成一种生态平衡。肠道菌群稳态对维持机体的正常功能具有重要作用。肠道菌群失衡可造成条件致病菌比例增加,共生菌比例下降,从而引起各种疾病。因而,肠道菌群被认为是人体内一个尚未被认识的“器官”,对研究疾病机制和开发新的治疗方法具有重要意义。急性髓性白血病的进展受到包括遗传和动态平衡环境在内多种因素的影响。越来越多的证据表明,人体肠道菌群多样性的改变会影响体内平衡环境,并与炎症、自身免疫性疾病和癌症的发生有关。有研究报道,CTLA-4抗体的抗肿瘤免疫治疗的效果主要依赖于肠道菌群;此外,在黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌和泌尿系上皮肿瘤患者中,肠道菌群紊乱可显著降低PD-1抑制剂的抗肿瘤作用,粪便菌群移植（FMT）或者口服益生菌改善肠道菌群后,可明显增强其抗肿瘤效果。总之,肠道菌群失调参与多种肿瘤的发生发展,而其在血液系统肿瘤的作用仍不明确,对其进行研究具有重要意义。随着研究的深入,肠道菌群与血液系统的关系逐渐被报道。据目前已有证据表明,肠道菌群可以调节和维持正常的稳态造血。最近,有报道发现急性淋巴细胞白血病（ALL）患者肠道菌群结构发生改变,微生物群体多样性显著降低。此外还有报道显示异基因造血干细胞移植（HCT）后肠道菌群的改变与胃肠道移植物抗宿主病（GVHD）的发生有关,提示肠道菌群可能是GVHD发病的重要因素。然而,肠道菌群在急性髓性白血病中所扮演的角色尚未明确,肠道菌群与AML因果关系如何,以及肠道菌群以何种方式参与疾病的进展,这些问题亟待进一步研究和解决。研究目的1、明确AML患者肠道中肠道菌群的构成情况以及与患者临床特征之间的关系。2、探究AML发生发展过程中肠道菌群的变化以及破坏菌群对疾病的影响,明确二者的因果关系。3、通过粪便菌群移植干预AML肠道菌群,探究菌群移植对逆转疾病进展的具体作用。研究方法1、标本采集:采集就诊于山东大学齐鲁医院的31例初诊急性髓性白血病患者及30例对照组的粪便、外周血及骨髓;将患者部分粪便冻存于-80℃保存,多余的粪便混合双蒸水搅拌均匀,过滤后加入甘油放入-80℃冻存;外周血和骨髓则使用EDTA抗凝管采集后,离心取上清,然后置于-80℃冰箱保存。2、AML患者肠道菌群的检测:使用16s rRNA测序的方法检测患者和正常对照粪便中细菌种类,并通过美吉云平台数据库进行α、β多样性分析。使用T检验和秩和检验来判定差异性大小。3、肠道菌群与患者临床特征相关性分析:用Logistic回归分析细菌数量与危险度分级的相关性,用Spearman相关分析细菌数量与白细胞的相关性,正态性检验采用Shapiro-Wilk检验,正态分布数据分析采用t检验或配对t检验。4、AML患者骨髓Th亚群的相关检测:流式细胞术检测AML患者与对照组骨髓的Th亚群比例,包括Th1、Th17和Treg。5、通过动物模型探究肠道菌群与AML进展的因果关系:使用MLL-AF9、AML1-ETO两种AML模型小鼠的骨髓原代细胞尾静脉注射C57BL/6J背景的野生型雌鼠体内,分别建立两种AML小鼠模型,并利用C1498小鼠白血病细胞系尾静脉注射入C57BL/6J背景的野生型雌鼠体内,建立C1498小鼠AML模型。利用16s rRNA测序检测以上三种模型小鼠的肠道菌群改变。同时口服氨苄青霉素、链霉素、新霉素和万古霉素的抗生素混合液,对小鼠进行肠道原有菌群的清除,将储存好的人类或者小鼠的粪便水化液通过灌胃的方式进行粪菌移植,应用流式细胞术的方法对动物模型的外周血、脾脏和骨髓的白血病细胞比例进行测定。研究结果1、AML患者存在肠道菌群的改变:通过16s rRNA测序,我们发现AML患者的肠道菌群多样性显著低于正常对照组,其中以α、β多样性的差异最为显著。AML患者与健康对照差异菌群具有明显的种属特异性:通过云平台分析证明,在门水平上,拟杆菌门在两组间有显著性差异,而在属层面上,Faecalibacterium和Roseburia在AML患者组中显著减少。通过Spearman相关分析证明,在AML患者粪便中显著减少的两种菌（Faecalibacterium和Roseburia）具有很强的正相关性,提示二者可能发挥着协同作用。2、肠道菌群与患者临床特征的相关性:通过Spearman相关分析和Logistic回归分析对临床特征和差异菌进行分析,发现Faecalibacterium和Roseburia与病人外周血白细胞数量呈显著负相关;Faecalibacterium与患者低危险度分级呈显著正相关;Faecalibacterium与患者骨髓中Treg细胞比例呈显著负相关关系。3、AML模型鼠中肠道菌群的变化:随着AML模型鼠的疾病进展,肠道菌群发生了显著变化。表现为发病后第14天,AML组小鼠肠道菌群多样性较正常组显著下降,β多样性显示两组菌群差异程度随AML进展逐渐增大。4、AML模型鼠中肠道菌群对白血病的作用:相较于普通AML模型鼠来说,使用抗生素破坏肠道菌群的AML模型鼠在脾脏、骨髓和外周血中的白血病细胞浸润更严重,生存期明显缩短。而使用菌群移植将抗生素处理组小鼠的肠道菌群恢复后,AML在小鼠体内的负荷明显缓解。研究结论1、AML患者存在肠道菌群多样性的减少,Faecalibacterium和Roseburia在AML患者粪便中显著减少,且与骨髓Treg细胞、外周WBC和危险分级呈负相关。2、AML的进展导致肠道菌群的失衡,而失衡的肠道菌群对AML的进展又有显著的影响。3、AML小鼠模型中,人类和小鼠粪便的粪菌移植均可显著影响AML在体内的进展。第二部分肠道菌群代谢产物及肠道屏障功能对急性髓性白血病进展的调控作用研究研究背景肠道菌群是一个由众多微生物组成的复杂生态系统,它们维持着胃肠道的稳态,并通过产生具有生物活性的代谢产物来发挥作用。肠道菌群的代谢能力大大超过了人体细胞的代谢能力,这些生物活性代谢产物可以直接或间接地影响宿主的生理机能。越来越多的研究表明,肠道菌群对宿主的大部分生物作用都与微生物的代谢产物有关,微生物产生的代谢产物是基于饮食影响宿主生理过程的关键介质。代谢产物不仅可以直接入血发挥作用,还可以通过影响肠道局部或肠道屏障来间接影响机体。一些代谢产物来源于肠道菌群,而不是宿主来源,它们介导了肠道菌群的生物学效应。肠道菌群代谢产物如短链脂肪酸（SCFAs）与血液疾病有关。Payen等人的研究结果显示,严重GVHD患者的主要短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）水平显著降低。此外,丁酸作为一种重要的SCFA,已被报道为肠上皮细胞的主要能量来源,给予丁酸可有效缓解GVHD,这一发现表明,肠道菌群可能通过代谢途径在疾病中发挥重要作用,特别是在GVHD中。然而,关于急性髓性白血病中短链脂肪酸的相关研究还较少见。肠道菌群及其SCFA代谢产物可以使肠上皮细胞的生长更加活跃,并可以调节其分化和修复。肠道屏障是阻止肠道菌群或代谢产物进入血液的唯一大门,它的完整性及其能否正常发挥作用,直接关系到血液中细菌及其代谢产物数量的变化。研究发现,肠道中的物理、化学、免疫和微生物屏障构成了完整的肠道屏障,对来自肠道的有害物质的入侵起着重要的防御作用。另一项研究证实,与健康志愿者相比,血液病GVHD患者表现出明显的肠道屏障功能丧失。肠道屏障的完整性和通透性通常决定肠道菌群及其代谢产物如何影响人体的系统免疫,急性髓性白血病的肠道屏障往往被忽视,关注肠道屏障可能为提高急性髓性白血病的治疗效果提供新的视角。研究目的1、明确AML患者粪便中代谢组学与正常对照组的差异;2、分析肠道差异代谢产物与差异菌群的相关性;3、探究肠道菌群代谢产物对原代白血病细胞及白血病细胞系的作用;4、阐明肠道菌群代谢产物对肠道屏障功能的影响及其机制;5、探究肠道菌群代谢产物对AML体内进展的影响及具体机制。研究方法1、代谢组学检测:将收集的AML患者和正常对照的粪便,血清样品在冰上解冻,采用Agilent7890A/5975C型GC-MS系统进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。在0.1～100μg/mL浓度范围内,建立短链脂肪酸的定量测定曲线,IS用于校正样品之间的变化和仪器响应中的微小变化。2、肠道菌群功能预测:使用picrust数据库,将肠道菌群多样性与数据库中资料进行比对,通过多种统计学方法推断出肠道菌群所对应的功能丰度与多组之间的功能差异。3、肠道菌群与代谢产物的差异分析:选取代谢组学中差异最显著的短链脂肪酸（丁酸,丙酸,乙酸）,同时选取差异最显著的细菌进行Spearman热图相关分析,分析两者是否具有明显的相关性。4、肠道菌群移植:使用抗生素破坏AML小鼠原有肠道菌群。使用制备好的粪水混合液对AML小鼠每日进行灌胃处理,16s rRNA检测细菌灌胃是否定植。5、丁酸对AML原代白血病细胞及细胞系的体外抑制作用:选取AML细胞系kasumi和THP-1以及AML小鼠的原代细胞,利用丁酸处理白血病细胞;应用CCK8检测不同浓度的丁酸在24小时和48小时时间点对其增殖的作用,另一方面通过流式细胞术检测丁酸处理24小时和48小时后的细胞凋亡情况。6、肠道屏障功能受损:取小鼠肠道,提取肠道上皮细胞,使用PCR、Western blot等手段检测紧密连接蛋白（ZO-1、claudin-1、claudin-2）表达量,使用免疫荧光对紧密连接蛋白进行定位,使用电镜进一步观察上皮细胞之间缝隙大小。研究结果1、非靶向代谢组学显示,AML患者粪便中代谢产物与正常对照组存在显著差异,其中短链脂肪酸丁酸和丙酸差异最为明显。2、AML患者粪便中代谢产物功能种类丰度明显下降,且短链脂肪酸（丁酸）代谢较正常对照明显降低。3、靶向代谢组学显示,粪便短链脂肪酸（乙酸、丁酸、丙酸）含量在AML患者中明显下降,且丁酸与差异肠道菌群（Faecalibacterium和Roseburia）呈显著正相关。4、丁酸处理白血病细胞系THP-1、Kasumi和C1498后,可明显抑制其增殖,促进凋亡。在体内,丁酸灌胃可显著延缓AML小鼠的病情进展,延长其生存期。5、AML小鼠肠道屏障功能受损,紧密连接蛋白Z0-1、claudin-1表达下降,给予丁酸灌胃可以对损伤的肠道屏障进行修复。研究结论1、AML患者粪便中代谢组学与正常对照组具有显著差异且功能多样性明显下降,短链脂肪酸含量降低明显;2、差异代谢产物与差异菌群具有显著的正相关关系;3、丁酸在体外可显著抑制白血病细胞的增殖;4、AML小鼠肠道屏障功能受损且可以被丁酸逆转。第三部分代谢产物LPS介导的NLRP3炎症小体在急性髓性白血病中的作用及机制研究AML是一种造血系统的恶性克隆性疾病,目前成人急性髓性白血病的治愈率仅有20%-40%。在过去的十年中,尽管在改善预后以及开发针对特定靶向分子的新疗法方面取得了一定进展,但阐明疾病的发病机制仍是提高AML治愈率的关键所在。根据上一部分研究,我们发现AML小鼠肠道屏障功能随着疾病进展呈受损状态,且与代谢产物的改变有着紧密的联系。因此屏障功能的改变如何影响AML的进展是我们接下来要研究的重点内容。LPS作为革兰氏阴性菌的主要菌体成分,可以引起炎症的产生。而肠道中的LPS可以通过肠道屏障进入外周血从而发挥其促炎作用。多篇文献报道,LPS可通过TLR4途径激活人类细胞中的NLRP3炎性小体,从而对机体产生重要的影响。然而在AML的进展中LPS是否可以通过激活NLRP3炎症小体来影响疾病的进展,目前仍不清楚。炎性小体是固有免疫中公认的重要角色,其中研究最透彻的是NLRP3炎性小体,NLRP3炎性小体复合物属于核苷酸结合和寡聚化域样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs）的家族,也被称为“含pyrin域的蛋白 3”,它主要包括NLRP3、ASC（Apoptosis-associated speck-like protein）和 caspase-1（Cysteinyl aspartate-specific proteases）这三种蛋白。NLRP3炎性小体与许多疾病密切相关,包括多发性硬化症、炎症性肠病以及其他自身免疫性疾病。尽管NLRP3炎性小体在肿瘤发生中的作用一直存在争议,但越来越多的证据表明NLRP3炎症小体促进慢性炎症反应,从而促进肿瘤的发生发展。NLRP3炎性小体的效应细胞因子IL-1 β或IL-18也被证明参与细胞增殖和分化,并被认为在肿瘤发生中起关键作用。NLRP3已被证实涉及多种血液疾病的发生和发展,然而,LPS如何通过NLRP3炎性小体促进AML的发生发展仍然未知。因此,我们探究了 LPS刺激下小鼠骨髓原代细胞中NLRP3炎性小体的基因表达情况,以期明确其在AML发生发展中的作用。研究目的1、明确肠道LPS的入血途径以及其在血液中的浓度变化;2、明确LPS刺激下小鼠白血病细胞NLRP3的表达差异;3、探究NLRP3在体内对AML进展的影响;4、阐明NLRP3下游效应分子IL-1β对白血病细胞增殖凋亡的作用及机制研究。研究方法1、AML患者及模型鼠LPS浓度的测定:使用酶联免疫吸附法（ELISA）检测AML患者及小鼠外周血中LPS浓度;同样检测丁酸处理组、抗生素破坏菌群组AML小鼠的LPS含量。2、PCR检测LPS刺激对AML细胞NLRP3炎症小体相关基因的表达影响。3、使用NLRP3慢病毒载体转染小鼠白血病细胞系C1498,成功转染后使用PCR、Western blot检测其目的基因的表达量。转染成功后尾静脉注射正常C57BL/6J小鼠,观察小鼠发病情况。4、提取NLRP3敲除鼠的骨髓,磁分选C-kit+HSC细胞,对其进行MLL-AF9慢病毒的转染,尾静脉注射正常C57BL/6J小鼠,建立NLRP3敲除AML小鼠模型。待模型建立完成,处死小鼠取其骨髓,作为NLRP3敲鼠白血病细胞,尾静脉注射C57BL/6J,建立NLRP3敲除的AML小鼠,观察其与普通AML小鼠的发病进展差异。5、使用小干扰在体外干预白血病细胞系的IL-1 β表达,CCK8检测细胞的增殖,流式细胞术检测其凋亡和对化疗药物（ADR、DNR）的敏感性。Western blot检测其BCL-2、caspase-3等凋亡蛋白的表达。研究结果1、AML小鼠存在明显的肠道屏障及功能受损,且受损的肠道屏障功能使LPS释放入血量加大,升高的LPS加速了 AML在小鼠体内的进展。2、LPS使小鼠白血病细胞NLRP3表达上调,且其下游基因CASPASE-1和IL-1 β也全部随之上调。3、慢病毒上调小鼠白血病细胞NLRP3加速小鼠AML进展,表现为肝脾肿大,骨髓浸润严重,生存期明显缩短。4、白血病细胞敲除NLRP3的AML小鼠,其脾脏骨髓浸润明显减轻,脾脏肿大现象得以缓解,骨髓GFP+白血病细胞数量明显减少,生存期延长。5、小干扰下调THP-1细胞系IL-1 β的表达后,抑制了 THP-1细胞增殖,促进其凋亡,促进了对阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性。研究结论1、肠道屏障受损可加速肠源性LPS入血,加速AML进展。2、在外源性LPS的刺激下,小鼠白血病细胞NLRP3基因表达显著增高。3、慢病毒上调NLRP3可促进小鼠AML进展,敲除小鼠白血病细胞NLRP3可延缓疾病进展。4、小干扰下调THP-1的NLRP3下游效应分子IL-1β后,可以促进白血病细胞增殖,抑制其凋亡,降低其对化疗药的敏感性。