玉米GBSS基因的克隆及其植物表达载体的构建

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普通玉米籽粒中大约有28%的直链淀粉和72%的支链淀粉。玉米直链淀粉是重要的工业原料,目前我国还没有育成高直链淀粉玉米。为提高玉米中直链淀粉的含量,获得高直链淀粉玉米,本研究首先克隆了胚乳特异表达启动子Gtl(水稻谷蛋白基因),并克隆了玉米中决定直链淀粉合成的关键基因GBSS(granule—bound starch synthase),将二者构建成高效表达的植物载体。通过调控GBSS基因,以期实现特定时期GBSS基因在玉米胚乳中的大量表达。获得如下结果: 以水稻基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了水稻谷蛋白基因Gtl的启动子序列,并将其构建到带有绿色荧光蛋白基因(GFP)的植物表达载体上,用微束激光穿刺法转化玉米的受体组织,通过瞬时表达的方法验证了该启动子的功能,结果表明在胚乳中有较强的表达,而在其它组织中表达很弱;证明了水稻谷蛋白基因Gtl的启动子在不同物种玉米中同样具有胚乳特异表达的功能。为这一胚乳特异启动子的广泛利用提供了理论依据。 根据已发表的玉米颗粒结合型淀粉合成酶GBSS基因序列,设计两对引物,其中一对为定点突变的过渡引物。从授粉后15d的玉米胚乳中提取总RNA,以反转录合成的cDNA第一链为模板,首次用定点突变、RT—PCR、融合PCR的方法克隆了GBSS基因的全长cDNA(1818bp)片段。序列测定表明,该片段与文献报道的序列具有99.72%的同源性。 构建了以胚乳特异表达性的Gtl为启动子,以NOS—ter为终止子的植物表达载体pBI—Gtl-GBSS,其含有NPT ||选择标记基因。通过基因枪轰击的方法将其转化到玉米幼胚,并建立和优化了玉米遗传转化体系,获得再生植株苗。从而为获得高直链淀粉玉米提供了理论和实验依据。
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