论文部分内容阅读
在当今社会，随着奶牛对代谢性、感染性和炎性疾病易感性的增加，奶牛养殖业承受着巨大的压力。乳腺炎仍然是奶牛在泌乳期最常见的炎性疾病，导致乳汁产量减少、品质下降、治疗费用增加。据统计，乳腺炎每年造成的经济损失在美国约为18亿美元，在中国约为150—450亿人民币。
金黄色葡萄球菌(S. aureus)是最常见和最具感染性的致病菌，可导致危及人类和动物生命的并发症。反刍动物是致病性金黄色葡萄球菌最重要的宿主之一，奶牛是重要的反刍动物同时也是人类重要的食用动物。抗生素是临床上治疗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的主要药物，但在治疗过程中产生的抗生素残留及耐药菌又会引发严重的食品安全和公共卫生问题，现在许多国家已被禁止使用。因此，兽医临床实际迫切需要科学有效的防治乳腺炎的药物。中药(Tradition Chinese Medicines TCM)对于细菌性炎性疾病具有良好的治疗效果，在食用动物行业有着广阔的应用前景。
本研究目的是阐明常春藤苷-C抑制TLRs-mediated介导的潜在奶牛乳腺炎炎性反应的调节通路及其作用机制，为临床治疗奶牛乳腺炎提供科学依据。
1.奶牛乳腺炎临床病理及炎症因子分析
乳腺炎是指乳腺组织的炎性反应，由细菌与Toll样受体(TLRs)结合后激活NF-κB/MAPK炎症信号通路，引起机体促炎细胞因子的表达，从而导致乳腺组织出现生理病理学的变化，引起炎症并造成乳腺组织损伤。
从中国湖北武汉某屠宰场收集奶牛的乳腺组织，进行组织病理学调查、病原学分离鉴定和炎症介质分析。组织病理学检查发现，感染的乳腺组织发生了明显的炎性病理学变化，具有丰富的多形核细胞，腺泡腔完整性受损，水肿和细胞碎片增多；乳腺导管和分泌性腺泡中含有细胞渗出液，单核细胞与嗜中性粒细胞大量混合性浸润。绵羊血琼脂和甘露醇盐琼脂培养成功地分离出金黄色葡萄球菌，表现出β型溶血和白色至淡黄色菌落，菌落在过氧化氢酶、凝固酶和甘露醇发酵试验中也呈阳性。Westernblot和qRT-PCR结果显示(P<0.05)，与未感染的组织相比，感染的组织中TLR2/TLR4与NF-κB/MAPKs通路相关物质均高表达(P<0.05)、促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)显著上调。以上结果表明，奶牛乳腺炎可由金黄色葡萄球菌感染引起，并产生严重的炎性反应和乳腺组织损伤，奶牛患浸润性细菌性“乳腺炎”的风险明显更高。
由于使用抗生素治疗易产生细菌耐药性和公共卫生问题，各国均在限制抗生素在畜牧业中的使用。大量临床实践表明，中药药毒性低、无残留不易产生耐药性。因此，本文利用常春藤苷-C(Hederacoside-HDC)具有的抗炎特性，研究其抑制乳腺炎的炎性应答和损伤的作用，并阐明其作用的分组机制。
2.常春藤苷-C通过调节细胞TLR2和TLR4抑制下游NF-κB和MAPKs信号通路
这项研究旨在评估HDC在体外乳腺炎模型中对引起病原体金黄色葡萄球菌的主要乳腺炎的抗炎作用，阐明HDC对金黄色葡萄球菌诱导的RAW264.7细胞发炎的抗炎作用的潜在机制。用CCK-8分析评估HDC对RAW264.7细胞的细胞毒性试验结果，HDC对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用。ELISA和qRT-PCR结果显示，浓度升高的HDC通过下调相关基因显著(P<0.05)抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，但是，通过上调相关基因显著(P<0.05)促进了抗炎细胞因子IL-10的释放。此外，通过蛋白质印迹分析研究了HDC作用于TLR、NF-κB和MAPKs的途径。对TLR的分子研究表明，HDC明显(P<0.05)抑制了金黄色葡萄球菌对TLR2和TLR4的激活。结果还显示，HDC以剂量依赖性方式显着(P<0.05)抑制了由金黄色葡萄球菌触发的p65、IκBα、p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化。以上结果表明(P<0.05)，HDC通过调节金黄色葡萄球菌触发的RAW264.7细胞TLRs抑制NF-κB和MAPKs信号级联，效地阻断了细胞的炎性应答和炎性损伤，对细胞发挥了保护作用。因而，HDC可能是对抗金黄色葡萄球菌诱导的炎症的潜在有效中药。
3.Hederacoside-C通过调节小鼠乳腺TLR2和TLR4抑制下游信号传导NF-κB和MAPK信号通路
为了研究HDC对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的体内抗炎作用，我们构建BALB/c小鼠乳腺炎模型，采用不同浓度的HDC(5 mg/Kg, 10 mg/Kg and 50 mg/Kg)体内实验，评估乳腺组织中相关信号调节通路物质的表达水平和炎性介质的变化。组织病理学变化和MPO活性试验显示(P<0.05)，HDC可以保护乳腺组织免受金黄色葡萄球菌诱导的炎性细胞浸润和组织破坏。ELISA，westernblot和qRT-PCR的结果显示(P<0.05)，HDC减弱TLR2和TLR4的表达，降低p38、ERK、JNK、p65和IκBα的磷酸化，进而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，增强IL-10的表达。
结论：综上所述，在RAW264.7细胞炎症模型中，我们确定了与药物抗炎特性相关的分子机制；在小鼠乳腺炎模型中，我们确认了炎性机制和药物作用。HDC 通过抑制MAPKs(p38，ERK，JNK)和NF-κB(p65＆IκBα)的磷酸化，显著(P<0.05)减弱了TLR2和TLR4的表达，进而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，增加IL-10的表达，增强了乳腺防御能力并减少了炎症损伤。本研究结果为常春藤苷-C在兽医临床应用及金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的防治药物的开发提供理论指导和帮助。
创新：①致病金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎主要致病菌之一。②HDC在乳腺炎中具有非常显著的抗炎作用，③其分子机制是：HDC通过抑制TLR2&TLR4表达降低其下游MAPKs和NF-κB信号通路的磷酸化，进而抑制促炎因子TNF-α、IL-1β&IL-6和提高抑炎因子IL-10的水平。
金黄色葡萄球菌(S. aureus)是最常见和最具感染性的致病菌，可导致危及人类和动物生命的并发症。反刍动物是致病性金黄色葡萄球菌最重要的宿主之一，奶牛是重要的反刍动物同时也是人类重要的食用动物。抗生素是临床上治疗金黄色葡萄球菌性乳腺炎的主要药物，但在治疗过程中产生的抗生素残留及耐药菌又会引发严重的食品安全和公共卫生问题，现在许多国家已被禁止使用。因此，兽医临床实际迫切需要科学有效的防治乳腺炎的药物。中药(Tradition Chinese Medicines TCM)对于细菌性炎性疾病具有良好的治疗效果，在食用动物行业有着广阔的应用前景。
本研究目的是阐明常春藤苷-C抑制TLRs-mediated介导的潜在奶牛乳腺炎炎性反应的调节通路及其作用机制，为临床治疗奶牛乳腺炎提供科学依据。
1.奶牛乳腺炎临床病理及炎症因子分析
乳腺炎是指乳腺组织的炎性反应，由细菌与Toll样受体(TLRs)结合后激活NF-κB/MAPK炎症信号通路，引起机体促炎细胞因子的表达，从而导致乳腺组织出现生理病理学的变化，引起炎症并造成乳腺组织损伤。
从中国湖北武汉某屠宰场收集奶牛的乳腺组织，进行组织病理学调查、病原学分离鉴定和炎症介质分析。组织病理学检查发现，感染的乳腺组织发生了明显的炎性病理学变化，具有丰富的多形核细胞，腺泡腔完整性受损，水肿和细胞碎片增多；乳腺导管和分泌性腺泡中含有细胞渗出液，单核细胞与嗜中性粒细胞大量混合性浸润。绵羊血琼脂和甘露醇盐琼脂培养成功地分离出金黄色葡萄球菌，表现出β型溶血和白色至淡黄色菌落，菌落在过氧化氢酶、凝固酶和甘露醇发酵试验中也呈阳性。Westernblot和qRT-PCR结果显示(P<0.05)，与未感染的组织相比，感染的组织中TLR2/TLR4与NF-κB/MAPKs通路相关物质均高表达(P<0.05)、促炎细胞因子(TNF-α，IL-1β和IL-6)显著上调。以上结果表明，奶牛乳腺炎可由金黄色葡萄球菌感染引起，并产生严重的炎性反应和乳腺组织损伤，奶牛患浸润性细菌性“乳腺炎”的风险明显更高。
由于使用抗生素治疗易产生细菌耐药性和公共卫生问题，各国均在限制抗生素在畜牧业中的使用。大量临床实践表明，中药药毒性低、无残留不易产生耐药性。因此，本文利用常春藤苷-C(Hederacoside-HDC)具有的抗炎特性，研究其抑制乳腺炎的炎性应答和损伤的作用，并阐明其作用的分组机制。
2.常春藤苷-C通过调节细胞TLR2和TLR4抑制下游NF-κB和MAPKs信号通路
这项研究旨在评估HDC在体外乳腺炎模型中对引起病原体金黄色葡萄球菌的主要乳腺炎的抗炎作用，阐明HDC对金黄色葡萄球菌诱导的RAW264.7细胞发炎的抗炎作用的潜在机制。用CCK-8分析评估HDC对RAW264.7细胞的细胞毒性试验结果，HDC对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用。ELISA和qRT-PCR结果显示，浓度升高的HDC通过下调相关基因显著(P<0.05)抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，但是，通过上调相关基因显著(P<0.05)促进了抗炎细胞因子IL-10的释放。此外，通过蛋白质印迹分析研究了HDC作用于TLR、NF-κB和MAPKs的途径。对TLR的分子研究表明，HDC明显(P<0.05)抑制了金黄色葡萄球菌对TLR2和TLR4的激活。结果还显示，HDC以剂量依赖性方式显着(P<0.05)抑制了由金黄色葡萄球菌触发的p65、IκBα、p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化。以上结果表明(P<0.05)，HDC通过调节金黄色葡萄球菌触发的RAW264.7细胞TLRs抑制NF-κB和MAPKs信号级联，效地阻断了细胞的炎性应答和炎性损伤，对细胞发挥了保护作用。因而，HDC可能是对抗金黄色葡萄球菌诱导的炎症的潜在有效中药。
3.Hederacoside-C通过调节小鼠乳腺TLR2和TLR4抑制下游信号传导NF-κB和MAPK信号通路
为了研究HDC对金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的体内抗炎作用，我们构建BALB/c小鼠乳腺炎模型，采用不同浓度的HDC(5 mg/Kg, 10 mg/Kg and 50 mg/Kg)体内实验，评估乳腺组织中相关信号调节通路物质的表达水平和炎性介质的变化。组织病理学变化和MPO活性试验显示(P<0.05)，HDC可以保护乳腺组织免受金黄色葡萄球菌诱导的炎性细胞浸润和组织破坏。ELISA，westernblot和qRT-PCR的结果显示(P<0.05)，HDC减弱TLR2和TLR4的表达，降低p38、ERK、JNK、p65和IκBα的磷酸化，进而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，增强IL-10的表达。
结论：综上所述，在RAW264.7细胞炎症模型中，我们确定了与药物抗炎特性相关的分子机制；在小鼠乳腺炎模型中，我们确认了炎性机制和药物作用。HDC 通过抑制MAPKs(p38，ERK，JNK)和NF-κB(p65＆IκBα)的磷酸化，显著(P<0.05)减弱了TLR2和TLR4的表达，进而抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，增加IL-10的表达，增强了乳腺防御能力并减少了炎症损伤。本研究结果为常春藤苷-C在兽医临床应用及金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的防治药物的开发提供理论指导和帮助。
创新：①致病金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎主要致病菌之一。②HDC在乳腺炎中具有非常显著的抗炎作用，③其分子机制是：HDC通过抑制TLR2&TLR4表达降低其下游MAPKs和NF-κB信号通路的磷酸化，进而抑制促炎因子TNF-α、IL-1β&IL-6和提高抑炎因子IL-10的水平。