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新城疫(Newcastle disease , ND)是危害我国以及大多数以农业收入为主的国家，并造成巨大经济损失的重要禽类疾病之一。目前发病最广泛的血清型为基因Ⅶ型，其中血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase, HN)是主要的保护性抗原之一。目前该病防治策略主要以预防为主，市售疫苗对其具有良好的保护效果，但仍存在一定的缺陷，如依赖于鸡胚生产及冷藏链运输等，因此对成本低廉、使用方便的新型疫苗的研究可为疫病防控提供新的选择。
目前预防新城疫的疫苗主要包括减毒疫苗和灭活疫苗。DNA疫苗又称为“第三代疫苗”，与传统疫苗相比有诸多优势，但质粒DNA本身由于尺寸问题，限制了其进入细胞核的能力，一定程度上影响其免疫效果。微环DNA(minicircle DNA, mcDNA)仅包含最基本的基因表达原件，无抗性标记基因、复制原点等细菌序列，可以增强在临床应用上的安全性，是一种新型疫苗载体。课题组前期构建了基于Cre重组酶的体内mcDNA表达系统，试验结果显示以延迟裂解型沙门菌为载体口服免疫保护效果显著优于传统DNA疫苗，具有很好的应用前景。但是该mcDNA系统在刺激机体产生特异性抗体水平方面仍显不足，抗体水平与灭活疫苗相比仍有较大差距。为了进一步增强mcDNA疫苗的免疫效力，本研究拟在原有mcDNA载体中真核启动子CMV的基础上，进一步引入原核启动子PpagC，构建出一种包含CMV和PpagC双启动子共表达基因Ⅶ型新城疫HN蛋白的mcDNA载体，以期进一步增强其刺激机体产生免疫反应的能力。本研究主要内容和结果如下：
1.携带PpagC启动子原核表达HN蛋白质粒的构建
利用生物信息学软件截取HN蛋白基因胞外区片段，连接到包含PpagC启动子的原核表达载体上。成功构建了质粒3342-PpagC-HNopt-Flag，并通过免疫印记试验(Western-blot， WB)验证了HN蛋白表达。
2.PCMV和PpagC共表达HN蛋白的mcDNA载体构建
本研究在课题组前期构建的mcDNA表达系统的基础上，将的PpagC-HNopt-Flag-TT基因表达框连接到微环质粒pYL46和pYL47。成功构建了包含CMV和PpagC双启动子的微环质粒pYL86和pYL87。将质粒转染HEK-293T细胞后通过间接免疫荧光和WB验证Cre重组酶、HNhis蛋白真核表达和HNopt-Flag蛋白原核表达，同时提取转染后的细胞核DNA，通过PCR技术验证mcDNA形成。结果显示本研究成功将PpagC-HNopt-Flag-TT表达框重组到真核表达载体，构建出PCMV和PpagC共表达HN蛋白的mcDNA载体。
3.疫苗菌株的构建及免疫效力评价
将微环质粒pYL86和pYL87转染到延迟裂解型沙门菌χ11218中，成功构建菌株χ11218(pYL86)和χ11218(pYL87)。试验动物选取雄性蛋鸡，待母源抗体消失后，分别在0d、14d、28d、42d免疫雏鸡，共计免疫四次，免疫剂量为109CFU/只。流式细胞术检测外周血CD4+T淋巴细胞增殖情况:3免后，χ11218(pYL87)组和χ11218(pYL86)组与生理盐水组相比显著增强外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.05；P＜0.01)，而与χ11218(pYL47)组差异不明显。4免后，χ11218(pYL47)组、χ11218(pYL86)组和χ11218(pYL87)组与生理盐水组相比能显著增强外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.001)；χ11218(pYL87)组与χ11218(pYL47)组及χ11218(pYL86)组相比能显著增强外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.05)。流式细胞术检测外周血CD8+T淋巴细胞增殖情况与CD4+T细胞类似:3免后，χ11218(pYL47)组、χ11218(pYL86)组和χ11218(pYL87)组与生理盐水组相比能显著增强外周血CD8+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.01；P＜0.001；P＜0.001)。4免后，χ11218(pYL87)组与生理盐水组和χ11218(pYL47)组相比能显著增强外周血CD8+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.001)。结果显示：免疫菌株χ11218(pYL87)整体上可以刺激外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞增殖，尤以4免后更为明显。其次，试验使用商品化ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-4和IFN-γ含量，免疫菌株χ11218(pYL87)后能够显著增加细胞上清中IL-4和IFN-γ含量。免疫后抗体监测结果表明，重组菌2免、3免及4免后鸡血清血凝抑制抗体(HI)产生不明显，ELISA检测结果表明χ11218(pYL86)、χ11218(pYL87)组血清IgY抗体滴度与χ11218(pYL47)组相比有一定提升，但差异不显著；相比之下，两者肠道及气管冲洗液sIgA抗体水平显著升高，尤以χ11218(pYL87)组更为明显。最后，以105ELD50Ⅶ型强毒株NA-1攻毒，通过攻毒保护效率、排毒情况、肺部组织病理组织学观察来评估菌株的保护效果。结果显示，χ11218(pYL87)组保护率为50%，而χ11218(pYL86)组及χ11218(pYL47)组保护率均为37.5%，灭活疫苗组保护率为100%。此外，与χ11218(pYL47)、χ11218(pYL86)组相比，χ11218(pYL87)组可以降低口咽和泄殖腔排毒检出率，并减轻肺部病理变化。结果显示，与初始mcDNA载体pYL47相比，增加的原核表达的HN蛋白可以增强外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖能力，细胞上清中IL-4和IFN-γ含量；虽然对血清HI抗体及IgY抗体水平影响不大，但可显著增强黏膜免疫水平及T细胞增殖能力对基因Ⅶ型新城疫攻毒的保护效率有一定提升。
本研究成功利用延迟裂解减毒沙门氏菌作为活载体，构建出一种包含CMV和PpagC双启动子共同表达基因Ⅶ型新城疫HN蛋白的mcDNA菌株，为开发新型兽用DNA疫苗奠定基础。
目前预防新城疫的疫苗主要包括减毒疫苗和灭活疫苗。DNA疫苗又称为“第三代疫苗”，与传统疫苗相比有诸多优势，但质粒DNA本身由于尺寸问题，限制了其进入细胞核的能力，一定程度上影响其免疫效果。微环DNA(minicircle DNA, mcDNA)仅包含最基本的基因表达原件，无抗性标记基因、复制原点等细菌序列，可以增强在临床应用上的安全性，是一种新型疫苗载体。课题组前期构建了基于Cre重组酶的体内mcDNA表达系统，试验结果显示以延迟裂解型沙门菌为载体口服免疫保护效果显著优于传统DNA疫苗，具有很好的应用前景。但是该mcDNA系统在刺激机体产生特异性抗体水平方面仍显不足，抗体水平与灭活疫苗相比仍有较大差距。为了进一步增强mcDNA疫苗的免疫效力，本研究拟在原有mcDNA载体中真核启动子CMV的基础上，进一步引入原核启动子PpagC，构建出一种包含CMV和PpagC双启动子共表达基因Ⅶ型新城疫HN蛋白的mcDNA载体，以期进一步增强其刺激机体产生免疫反应的能力。本研究主要内容和结果如下：
1.携带PpagC启动子原核表达HN蛋白质粒的构建
利用生物信息学软件截取HN蛋白基因胞外区片段，连接到包含PpagC启动子的原核表达载体上。成功构建了质粒3342-PpagC-HNopt-Flag，并通过免疫印记试验(Western-blot， WB)验证了HN蛋白表达。
2.PCMV和PpagC共表达HN蛋白的mcDNA载体构建
本研究在课题组前期构建的mcDNA表达系统的基础上，将的PpagC-HNopt-Flag-TT基因表达框连接到微环质粒pYL46和pYL47。成功构建了包含CMV和PpagC双启动子的微环质粒pYL86和pYL87。将质粒转染HEK-293T细胞后通过间接免疫荧光和WB验证Cre重组酶、HNhis蛋白真核表达和HNopt-Flag蛋白原核表达，同时提取转染后的细胞核DNA，通过PCR技术验证mcDNA形成。结果显示本研究成功将PpagC-HNopt-Flag-TT表达框重组到真核表达载体，构建出PCMV和PpagC共表达HN蛋白的mcDNA载体。
3.疫苗菌株的构建及免疫效力评价
将微环质粒pYL86和pYL87转染到延迟裂解型沙门菌χ11218中，成功构建菌株χ11218(pYL86)和χ11218(pYL87)。试验动物选取雄性蛋鸡，待母源抗体消失后，分别在0d、14d、28d、42d免疫雏鸡，共计免疫四次，免疫剂量为109CFU/只。流式细胞术检测外周血CD4+T淋巴细胞增殖情况:3免后，χ11218(pYL87)组和χ11218(pYL86)组与生理盐水组相比显著增强外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.05；P＜0.01)，而与χ11218(pYL47)组差异不明显。4免后，χ11218(pYL47)组、χ11218(pYL86)组和χ11218(pYL87)组与生理盐水组相比能显著增强外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.001)；χ11218(pYL87)组与χ11218(pYL47)组及χ11218(pYL86)组相比能显著增强外周血CD4+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.05)。流式细胞术检测外周血CD8+T淋巴细胞增殖情况与CD4+T细胞类似:3免后，χ11218(pYL47)组、χ11218(pYL86)组和χ11218(pYL87)组与生理盐水组相比能显著增强外周血CD8+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.01；P＜0.001；P＜0.001)。4免后，χ11218(pYL87)组与生理盐水组和χ11218(pYL47)组相比能显著增强外周血CD8+T淋巴细胞增殖能力(P＜0.001)。结果显示：免疫菌株χ11218(pYL87)整体上可以刺激外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞增殖，尤以4免后更为明显。其次，试验使用商品化ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-4和IFN-γ含量，免疫菌株χ11218(pYL87)后能够显著增加细胞上清中IL-4和IFN-γ含量。免疫后抗体监测结果表明，重组菌2免、3免及4免后鸡血清血凝抑制抗体(HI)产生不明显，ELISA检测结果表明χ11218(pYL86)、χ11218(pYL87)组血清IgY抗体滴度与χ11218(pYL47)组相比有一定提升，但差异不显著；相比之下，两者肠道及气管冲洗液sIgA抗体水平显著升高，尤以χ11218(pYL87)组更为明显。最后，以105ELD50Ⅶ型强毒株NA-1攻毒，通过攻毒保护效率、排毒情况、肺部组织病理组织学观察来评估菌株的保护效果。结果显示，χ11218(pYL87)组保护率为50%，而χ11218(pYL86)组及χ11218(pYL47)组保护率均为37.5%，灭活疫苗组保护率为100%。此外，与χ11218(pYL47)、χ11218(pYL86)组相比，χ11218(pYL87)组可以降低口咽和泄殖腔排毒检出率，并减轻肺部病理变化。结果显示，与初始mcDNA载体pYL47相比，增加的原核表达的HN蛋白可以增强外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖能力，细胞上清中IL-4和IFN-γ含量；虽然对血清HI抗体及IgY抗体水平影响不大，但可显著增强黏膜免疫水平及T细胞增殖能力对基因Ⅶ型新城疫攻毒的保护效率有一定提升。
本研究成功利用延迟裂解减毒沙门氏菌作为活载体，构建出一种包含CMV和PpagC双启动子共同表达基因Ⅶ型新城疫HN蛋白的mcDNA菌株，为开发新型兽用DNA疫苗奠定基础。