研究背景及目的糖尿病（DM）属于一种发病率较高的内分泌代谢疾病,相关国际调查研究发现,截至2019年全球成人糖尿病患者已经超过4.6亿,且每年有四百多万患者因此而死亡,国内大约有1.164亿糖尿病患者。根据现有的数据预测,25年后全球糖尿病患者会达到6.29亿,因而很有必要对糖尿病的病理和治疗方法进行研究。糖尿病心肌病（DCM）是长期罹患糖尿病而引起的严重并发症之一,以糖尿病患者在没有冠心病和高血压等情况下,出现心肌肥厚,收缩功能障碍等结构和功能的异常为主要特征,能够极大的增加患者心力衰竭的风险,现已成为糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前,临床上尚缺乏能有效预防和治疗糖尿病心肌病的药物,而随着糖尿病及其并发症带来的日益加重的社会和经济负担,开发出具有防治糖尿病心肌病的药物尤为迫切。桑叶是桑科植物桑的干燥叶,在中医治疗领域经常应用。2019年国家卫健委将其纳入“药食同源”中药目录。桑叶作为中草药最早出现于《神农本草经》,其性寒,归肺、肝经;可起到凉血散风的效果,且还可实现清肺、明目治疗功效。其兼有清、润两种功效,其“甘”味可以益血,配合其寒凉药性,能产生下气而益阴的效果,从而能治疗阴虚内热;经霜后则兼有渭肃的特性,故又能明目而止消渴。桑叶治疗消渴病最早记载于著名的中药学专著《本草纲目》:“叶煎代茗,能止消渴”。目前,在桑叶降糖作用成为研究热点,已证实桑叶中生物碱“1-脱氧野尻霉素”（1-DNJ）能抑制二糖类分解酶活性,并且其中生物碱及桑叶多糖能促进β细胞分泌胰岛素产生降糖作用,而桑叶是否在降糖同时能够预防和治疗糖尿病心肌病鲜有报道。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用法定量分析桑叶提取物（MLE）中的主要成分,结合动物和细胞实验,评价MLE及其主要成分对小鼠DCM的药效,并对其作用机制进行分析,为相关改善DCM的药物研发起到参考作用。研究方法1、桑叶提取物化学成分的测定在此实验检测过程中应用了UPLC-MS技术,综合分析而选择Poroshell 120EC-C18色谱柱,对应的流动相为乙腈-0.1%甲酸水。在检测时梯度洗脱MLE溶液,进样检测其中主要化学成分的含量。2、桑叶提取物及其主要成分对小鼠DCM的防治作用通过对MLE、1-DNJ、CA及RESV的药效学对照实验,探讨MLE中发挥保护DCM心脏作用的主要成分。使用高糖脂饲料（HFD）联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法建立DCM小鼠模型,造模成功后即开始给药,以临床一线降糖药物二甲双胍（Met）为常规治疗药物,干预12周,期间监测小鼠血糖及体重变化,药物干预结束后,通过小鼠心脏超声检测小鼠的心功能;检测小鼠糖化血清蛋白（GSP）评价各药物对小鼠血糖的影响;检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）评价各药物对肝功能的影响及药物安全性;检测小鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、脂蛋白胆固醇相关的指标,在此基础上分析药物对脂肪代谢的作用。评价MLE及其中等比例剂量的单体化合物保护小鼠DCM心脏功能的作用,同时筛选出发挥作用的主要功效成分。3、1-脱氧野尻霉素对小鼠DCM防治作用的量效关系进一步探究发挥较优改善DCM作用的成分——1-DNJ,对小鼠DCM心脏保护作用的量效关系。小鼠DCM造模成功后随机分组,分别给予25 mg/kg、50 mg/kg及100 mg/kg的1-DNJ,以二甲双胍（Met）为常规治疗药物,干预12周,期间监测小鼠血糖及体重变化,药物干预结束后,心脏超声检测小鼠的心功能;检测小鼠糖化血清蛋白（GSP）评价各药物对血糖的影响;小鼠心肌组织基于染色方法进行判断;检测心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）的表达水平,根据所得结果而评价小鼠DCM的心肌组织氧化应激水平。4、1-脱氧野尻霉素对小鼠DCM防治作用的初步机制通过体内、体外实验,探究1-DNJ对DCM防治的作用机制。小鼠DCM造模成功后,给予药物干预12周,利用SIRT1抑制剂EX527研究1-DNJ的作用靶点,末次给药后,小鼠超声检测心功能,心脏组织HE染色、MASSON染色及电子显微镜观察心肌结构变化,通过心肌组织ROS染色及SITR1、SOD、NQO-1及HO-1蛋白表达水平而评价氧化应激水平,以心肌组织胶原相关免疫组化染色及检测TGF-β、α-SMA、SMAD2/3、p-SMAD2/3蛋白表达评价心肌纤维化通路的激活程度。使用H9c2细胞系建立细胞实验模型,以高糖培养基模拟体外糖尿病环境造模,利用SIRT1si RNA观测1-DNJ的作用靶点。通过对H9c2细胞进行ROS染色、检测SITR1、Ac-SOD、SOD、NQO-1及HO-1蛋白表达水平,以及TGF-β、α-SMA、p-SMAD2/3蛋白表达水平,评价1-DNJ抑制心肌纤维化通路的可能机制。研究结果1、MLE中主要检出7种化合物:通过对MLE的定量分析,检测出其中生物碱类化合物1-DNJ含量为5.47%,苯丙素类化合物绿原酸（CA）含量为1.21%,非黄酮类多酚化合物白藜芦醇（RESV）含量为0.39%,具有较高的含量。其他成分如隐绿原酸（CCA）含量为0.03%,二苯乙烯类化合物桑皮苷A（MLA）含量为0.04%,香豆素类化合物东莨菪内酯（Sco）为0.09%,黄酮类化合物紫云英苷（Astr）为0.04%,含量则相对较少。2、1-DNJ对DCM的疗效明显优于MLE中其他化学成分:以MLE及其中含量较高的1-DNJ、CA和RESV为试药,观察其对DCM的作用。结果显示,MLE能够改善DCM小鼠糖脂代谢紊乱的症状,同时通过减轻心肌纤维化、降低心肌氧化应激水平保护DCM小鼠心功能,减轻糖其的心肌损伤程度。按照在MLE中的占比设置的各成分等比例剂量给药后,1-DNJ对DCM的疗效与MLE无显著差异（P＞0.05）;CA能够改善DCM小鼠心功能,但在减轻心肌纤维化、改善血糖方面效果不显著（P＞0.05）;RESV对DCM小鼠的血糖、血脂及心功能均无明显改善作用（P＞0.05）。3、1-DNJ作为MLE的功效成分对改善DCM具有明显量效关系:实验结果显示,1-DNJ能够显著改善DCM小鼠的左室射血分数、减轻心肌肥厚、减轻心肌纤维化、降低心肌氧化应激水平,并在25 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的剂量区间呈现正相关特性。4、1-DNJ防治DCM的机制与其激活SIRT1通路相关:1-DNJ可有效激活DCM小鼠心肌组织和高糖损伤后的H9c2细胞中SIRT1通路,促进Ac-SOD2去乙酰化,进而产生乙酰化活性产物SOD2,加速ROS的清除,降低氧化应激水平,进而抑制TGF-β/Smad2/3通路的激活,减少纤维化标志物α-SMA的表达,有效的减轻糖尿病诱导的氧化应激损伤及心肌纤维化。研究结论1、首次建立同时检测桑叶提取物中多成分含量检测方法。桑叶提取物中化学成分含量从高到低依次是1-DNJ、绿原酸、白藜芦醇、桑皮苷A、东莨菪内酯、紫云英苷和隐绿原酸,该方法具有操作简便、重复性良好等特点。2、证实1-DNJ是MLE防治DCM的功效成分。依据MLE及其所含等剂量主要成分的药效学实验证实,1-DNJ是MLE中防治DCM的功效成分。3、1-DNJ防治DCM明显呈剂量正相关。1-DNJ在25mg/kg-100mg/kg的剂量区间内,对糖尿病心肌病的防治作用呈现出浓度依赖关系。4、1-DNJ防治DCM机制与其上调SIRT1的表达有关。1-DNJ可促进去乙酰化底物Ac-SOD2转为SOD2,减轻高糖诱导的氧化应激损伤,进而抑制TGF-β/Smad2/3通路的激活,减轻糖尿病诱导的氧化应激损伤及心肌纤维化。