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牙外伤（Traumatic dental injury,TDI）是指牙齿受到急剧创伤,特别是打击或者撞击所引起的牙体硬组织、牙髓组织和牙周支持组织等的损伤。牙外伤是口腔常见的急症,是仅次于龋病造成儿童牙齿缺损或缺失的第二大疾患。对于生长发育期的儿童来说,牙外伤不仅会对儿童的牙合颌生长发育造成一定的阻碍,也会对儿童的心理状态产生不良影响。由于儿童颌面部骨骼发育的特点,受到外伤时常会造成牙齿的移位性损伤,不仅可能造成牙髓组织病变坏死,还会使牙周支持组织撕裂,导致牙周组织不良愈合。一些严重的移位性损伤（如全脱出）预后情况复杂多样,难以预测,经常会导致牙根吸收致使患牙拔除。现有的治疗方式主要是对患牙进行固定及牙髓治疗以预防牙根进行性吸收,同时促进牙周膜愈合,但是这些治疗方式临床有效性不足,不能完全恢复牙齿生理功能。如何提高外伤牙牙周组织预后,使损伤的牙周膜组织恢复或再生,能够继续行使生理功能是目前研究的一个热点。因此,了解外伤牙的流行病学特点及治疗预后情况,对于进一步改进外伤牙的治疗方式和提高预后疗效具有重要意义。组织工程再生主要是应用干细胞与支架材料,综合生长因子的作用,进行原位或者异位移植,进而实现组织或器官再生。牙周组织再生领域中使用组织工程技术已经成为一个热点。乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED）是一类处于发育早期的干细胞,具有较好的增殖、分化及免疫调节能力,细胞聚合体（cell aggregate,CA）技术可以保留大量细胞外基质,仿生体内细胞的微环境,使组织工程再生效率得到极大提高。有大量实验证明使用干细胞聚合体技术可以促进牙周组织恢复和再生,其中牙槽骨是牙周组织的重要组成部分,实现牙槽骨再生是获得牙周组织再生的关键环节,除此之外,牙周组织再生的整个过程是发生在无血管无活性的牙体硬组织上,需要周围血管的支持,因而牙周血管系统的重建对于牙周组织的再生或者愈合有重要作用,但是关于牙周组织骨和血管再生的研究不足,其具体机制尚待进一步研究。近年来,研究发现细胞旁分泌作用在组织再生中发挥关键作用,外泌体（exosomess）是细胞主动分泌的一种直径在30-150nm的细胞外囊泡,含有多种蛋白质,mRNA等物质,是细胞旁分泌途径之一,也是细胞间传递信息的重要方式。本研究拟通过牙外伤预后回顾性分析,分离细胞及外泌体、联合体外细胞功能研究及体内组织再生研究,明确外泌体在牙周组织再生,尤其是牙周骨组织及血管再生中的作用,为牙外伤治疗及牙周组织再生提供潜在的策略和实验依据。第一部分:西安地区儿童牙周组织损伤外伤牙牙周组织预后的回顾性分析目的:分析西安地区儿童牙周组织损伤外伤牙的流行病学特征及牙周组织预后情况。方法:按照一定的纳入和排除标准,收集2019.06～2020.05在空军军医大学口腔医院儿童口腔科就诊的牙外伤患者病例,对患者的性别,年龄,外伤类型,牙位,预后情况及影响预后的因素进行回顾性分析,以明确西安地区儿童牙外伤的基本流行病学特点及牙周组织外伤牙的牙周组织预后情况及相关因素,为牙外伤的流行病学调查提供参考,并且为提高牙周组织预后的研究提供临床研究背景。结果:西安地区儿童牙外伤流行病学特征如下:患儿性别分布为男性多于女性,年龄集中于7-10岁年龄段,外伤牙位多为上颌中切牙及侧切牙。牙周组织损伤的比例在所有牙外伤中占比为49.3%。分析与预后可能相关的因素发现,牙外伤类型与预后结果具有显著相关性（P=0.015）。严重的牙周组织损伤如挫入和全脱出的预后较差,预后不良率分别为62.5%和54.5%。结论:西安地区儿童牙外伤的流行学分布特性呈现男性多于女性,年龄集中于7-10岁年龄段,且外伤牙位集中上前牙的特点。牙外伤类型与预后情况具有显著相关性,且挫入及全脱出预后较差。第二部分:SHED-CA通过外泌体促进牙周组织再生的体外研究目的:探究SHED-CA来源外泌体对颌骨骨髓间充质干细胞（Jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs）功能的影响。方法:通过体外分离和培养SHED及JBMMSCs,研究SHED对JBMMSCs功能（成骨及成血管功能）的影响,并且通过进一步提取SHED及SHED-CA外泌体,使用实时定量PCR（quantitative real-time PCR,QPCR）,蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）及体外成血管实验观察两种不同来源外泌体对人脐静脉血管内皮细胞（shuman umbilical vein endothelial cells,HUVEC）的成血管功能及JBMMSCs功能（成骨及成血管功能）的影响。结果:分离的SHED及JBMMSCs具有间充质干细胞特征性的自我更新及多向分化能力。成功分离SHED及SHED-CA来源外泌体,并且进行透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）、蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）及纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）鉴定确定其符合外泌体特征。SHED及SHED-CA来源的外泌体可以直接促进HUVECs的体外成血管能力,并且使用这两种来源的外泌体对JBMMSCs进行处理后,JBMMSCs成骨成血管相关基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、I型胶原（Collagen I,COL-I）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,RUNX2）及内皮血管生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达上升（P＜0.05）,成骨成血管相关蛋白ALP、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、RUNX2及VEGF表达上升（P＜0.05）,提示SHED及SHED-CA外泌体促进JBMMSCs成骨成血管能力。但是,经过SHED及SHED-CA来源外泌体处理的JBMMSCs的体外成血管能力未见明显提高（P＞0.05）,提示外泌体不能直接促进JBMMSCs对HUVECs的成血管能力。结论:SHED及SHED-CA来源的外泌体均可以促进JBMMSCs的成骨和成血管功能。第三部分:SHED-CA通过外泌体促进牙周组织再生的体内研究目的:通过动物体内实验,探究SHED-CA及其外泌体对牙周组织再生的影响。方法:以6周龄的雌性SD大鼠为实验动物,建立牙周组织缺损模型。实验分组为正常组,对照组,SHED-CA组及SHED-CA+Rab27a shRNA组。正常组:未经过手术处理的正常SD大鼠;对照组:进行模型建立的手术,未植入SHED-CA;SHED-CA组:建模后植入SHED-CA;SHED-CA+Rab27a shRNA组:建模后植入转染Rab27a shRNA的SHED-CA。每组实验动物数量n=6只。确定模型建立成功后,分离培养不同组别大鼠植入区局部JBMMSCs,观察不同手术处理对植入区局部细胞的功能（增殖分化,成骨及成血管功能）的影响。术后8w,对实验动物进行取材切片,观察牙周组织中骨组织和血管的再生情况。结果:成功建立了大鼠牙周组织缺损模型。不同组别的大鼠JBMMSCs（R-JBMMSCs）WB检测的结果显示,SHED-CA组JBMMSCs成骨相关蛋白ALP表达与正常组有显著差异（P＜0.05）,且SHED-CA组JBMMSCs成骨相关蛋白OPN表达与对照组有显著差异（P＜0.05）。但正常组,对照组和SHED-CA组R-JBMMSCs在增殖能力和成骨成血管相关蛋白RUNX2和VEGF的表达上无明显差异（P＞0.05）。术后8w组织HE染色结果显示,相比对照组,SHED-CA组有明显的骨和血管再生。术后8w组织免疫荧光染色显示,SHED-CA+Rab27a shRNA组成骨相关蛋白ALP及血管相关蛋白VEGF表达强于对照组,弱于SHED-CA组,提示SHED-CA外泌体在介导SHED-CA促进牙周组织骨及血管再生中发挥重要作用。结论:SHED-CA促进牙周组织再生中骨及血管的形成,并且这一作用通过外泌体途径实现。