研究背景:脑胶质瘤（glioma）为常见的中枢神经系统原发恶性肿瘤,具有预后差、复发率高以及死亡率高的特点。目前的标准治疗方案为手术切除后联合放疗及替莫唑胺（temozolomide,TMZ）化疗。但是,脑胶质瘤细胞极易对TMZ产生耐药性,导致TMZ疗效降低甚至丧失。因此,临床迫切需要开发新的脑胶质瘤治疗方法。脑胶质瘤相关巨噬细胞（glioma associated macrophage,GAM）包括分布于脑胶质瘤微环境中的小胶质细胞和骨髓源性巨噬细胞。GAM分泌的相关因子（如TGF-β）可促进脑胶质瘤细胞的迁移及侵袭。脑胶质瘤组织的低氧环境更有利于募集M2型GAM至肿瘤组织,进而促进脑胶质瘤部位血管生成。研究表明,选择性消除M2型GAM可有效抑制肿瘤生长,恢复肿瘤微环境中的免疫监视。因此,耗竭M2型GAM是一种治疗耐药脑胶质瘤的新策略。唑来膦酸（zoledronate,ZOL）为双膦酸盐化合物,可通过阻断甲羟戊酸途径中法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）的表达诱导肿瘤细胞凋亡。同时,ZOL可消除肿瘤相关的巨噬细胞,提高肿瘤部位M1型巨噬细胞的比例,具有逆转脑胶质瘤组织免疫抑制微环境的潜力。然而,由于ZOL对骨组织具有高亲和力,难以有效地蓄积在脑胶质瘤部位,因此需要构建合适的递药系统将ZOL递送至脑胶质瘤部位。小胶质细胞可通过脑胶质瘤细胞分泌的相关因子（CX3CL1和CSF-1）,被募集至脑胶质瘤部位,因此采用小胶质细胞膜包被纳米粒,制备核壳型仿生纳米粒,可将ZOL递送至脑胶质瘤部位。此外,由于肿瘤细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度远高于血液和组织液,采用具有谷胱甘肽响应的载体包载ZOL,可使ZOL在脑胶质瘤细胞内释药,发挥抗耐药脑胶质瘤作用。目的:采用具有GSH响应的聚二硫二丙酸丙二醇酯包载ZOL,形成纳米粒的核,以小胶质细胞（BV2细胞）膜为壳,采用挤压法制备核壳型仿生纳米粒,将ZOL靶向递送至脑胶质瘤部位,抑制耐药脑胶质瘤细胞生长,同时逆转脑胶质瘤组织的免疫抑制微环境,发挥协同抗耐药脑胶质瘤作用。方法:1.以二硫二丙酸和丙二醇为原料,合成聚二硫二丙酸丙二醇酯,通过核磁氢谱及红外光谱对化合物结构进行鉴定。2.采用复乳化溶剂挥发法制备载ZOL纳米粒核（ZOL@NPs）,并对制备处方工艺进行优化;采用挤压法将BV2细胞膜包被于ZOL@NPs表面,制备核壳型仿生纳米粒（ZOL@CNPs）;采用动态激光粒度仪、高效液相色谱（HPLC）等方法对ZOL@CNPs的粒径、zeta电位、载药量、形态、稳定性、释药特性及溶血作用进行表征。3.采用MTT实验、克隆形成实验考察ZOL@CNPs对GL261细胞及耐替莫唑胺GL261细胞（GL261/TR细胞）的细胞毒性;采用细胞迁移实验和细胞侵袭实验研究ZOL@CNPs对GL261细胞和GL261/TR细胞迁移和侵袭能力的影响。4.采用GSH及ROS检测试剂盒测定ZOL@CNPs对GL261/TR细胞中GSH水平及ROS水平的影响。5.采用western blot实验检测ZOL@CNPs对GL261/TR细胞凋亡相关蛋白及上皮间质转换（EMT）相关蛋白表达的影响。6.采用倒置显微镜观察ZOL@CNPs对HUVEC细胞微管形成能力的影响。7.采用激光共聚焦显微镜（CLSM）及HPLC考察GL261/TR细胞对ZOL@CNPs的摄取;采用CLSM考察GL261/TR细胞与BV2细胞、RAW264.7细胞、HT-22细胞共孵育时,ZOL@CNPs在4种细胞中的蓄积;采用CLSM考察GL261/TR细胞对ZOL@CNPs的摄取机制以及CX3CL1及CX3CR1对GL261/TR细胞摄取ZOL@CNPs的影响。8.采用小鼠脑微血管内皮细胞（b End3细胞）构建体外血脑屏障,通过HPLC考察ZOL@CNPs跨体外血脑屏障转运效率及其机制。9.通过脑部注射Luc-GL261/TR细胞,构建小鼠原位耐药脑胶质瘤模型,采用活体成像仪观察ZOL@CNPs在原位耐药脑胶质瘤小鼠体内的分布以及ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤生长的抑制作用。10.采用H＆E染色观察ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤组织细胞形态的影响;采用western blot实验研究ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤组织内凋亡及EMT相关蛋白表达的影响;采用免疫组织化学方法研究ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤肿瘤组织内M1型GAM与M2型GAM比例的影响,采用ELISA方法检测ZOL@CNPs对耐药脑胶质瘤组织内M1型GAM及M2型GAM相关细胞因子含量的影响;采用免疫组织化学方法观察ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤小鼠肿瘤组织内TUNEL阳性细胞以及Ki67、HIF-1α、CD31表达的影响。11.采用生化分析仪检测ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤小鼠血清中尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）的含量,以及血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性的影响。采用H＆E染色观察ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤小鼠主要正常器官组织形态的影响。结果:1.合成了聚二硫二丙酸丙二醇酯,核磁氢谱及红外光谱证实为目标化合物。2.ZOL@CNPs平均粒径为204 nm,平均zeta电位为-20.68 m V,载药量为4.73%,且具有谷胱甘肽敏感释药特性。3.MTT实验、克隆形成实验、细胞迁移及细胞侵袭实验结果表明ZOL@CNPs在体外对GL261细胞和GL261/TR细胞均具有较强的细胞毒性,可抑制GL261细胞和GL261/TR细胞的克隆形成,以及GL261细胞和GL261/TR细胞的迁移和侵袭,作用强于同浓度ZOL@NPs。4.ZOL@CNPs降低了GL261/TR细胞内GSH水平,提高了GL261/TR细胞内ROS水平,而且作用强于同浓度的ZOL@NPs。提示ZOL@CNPs可打破GL261/TR细胞内氧化还原平衡,造成氧化应激,加剧GL261/TR细胞的凋亡。5.Western blot实验结果显示,ZOL@CNPs可降低GL261/TR细胞中Bcl-2、N-cadherin、CD44及TGF-β蛋白表达,增加E-cadherin、Bax、Caspase 3及Cleaved caspase 3蛋白表达。提示ZOL@CNPs可激活GL261/TR细胞中Caspase依赖的凋亡途径,可抑制GL261/TR细胞中上皮间质转化（EMT）的发生。6.ZOL@CNPs体外可抑制HUVEC细胞微管形成,提示ZOL@CNPs能够抑制血管形成。7.GL261/TR细胞对ZOL@CNPs的摄取显著高于ZOL及ZOL@NPs;当GL261/TR细胞与BV2细胞、RAW264.7细胞、HT-22细胞共孵育时,ZOL@CNPs更多的蓄积在GL261/TR细胞中,而ZOL@NPs更多的蓄积在BV2细胞及RAW264.7细胞中;GL261/TR细胞通过小窝蛋白介导的内吞途径以及大胞饮途径摄取ZOL@CNPs;当阻断GL261/TR细胞中CX3CL1及ZOL@CNPs中CX3CR1时,GL261/TR细胞对ZOL@CNPs的摄取显著减少。提示ZOL@CNPs通过CX3CR1与CX3CL1的相互作用选择性蓄积于GL261/TR细胞中。8.ZOL@CNPs跨体外血脑屏障转运效率显著高于ZOL及ZOL@NPs;ZOL@CNPs跨体外血脑屏障转运后,仍可有效地蓄积于GL261/TR细胞中;当加入细胞因子CX3CL1、CSF-1及GL261/TR细胞时,ZOL@CNPs体外跨血脑屏障转运效率显著提高。提示GL261/TR细胞分泌的细胞因子CX3CL1及CSF-1可牵引ZOL@CNPs有效地跨血脑屏障并蓄积至耐药脑胶质瘤区域。9.成功建立了原位耐药脑胶质瘤小鼠模型。相比于ZOL@NPs,ZOL@CNPs更多的蓄积于小鼠原位耐药脑胶质瘤部位。ZOL@CNPs可抑制小鼠原位耐药脑胶质瘤的生长,延长原位耐药脑胶质瘤小鼠的生存时间,且作用优于ZOL及ZOL@NPs。10.H＆E染色结果显示,ZOL@CNPs治疗组肿瘤区域显著缩小,而且肿瘤细胞病理性核分裂显著减少。ZOL@CNPs治疗组小鼠耐药脑胶质瘤组织中Bcl-2、N-cadherin、CD44、TGF-β蛋白表达显著降低,而E-cadherin、Bax、Caspase 3、Cleaved caspase 3蛋白表达明显升高;ZOL@CNPs显著增加了耐药脑胶质瘤组织中TUNEL阳性细胞数,降低了耐药脑胶质瘤组织Ki67的表达。与生理盐水组相比,ZOL@CNPs显著提高了耐药脑胶质瘤组织中M1型GAM与M2型GAM之间的比例,以及M1型GAM相关细胞因子的含量;ZOL@CNPs显著降低了耐药脑胶质瘤组织HIF-1α以及CD31的表达。11.ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤小鼠血清中ALT和AST的活性,以及BUN和CREA的含量无显著影响。H＆E染色结果显示,ZOL@CNPs对原位耐药脑胶质瘤小鼠主要正常器官组织未造成明显损伤。结论:ZOL@CNPs具有GSH敏感的响应特性,可在耐药脑胶质瘤细胞分泌的CX3CL1及CSF-1的作用下被募集至小鼠原位耐药脑胶质瘤区域,显著抑制小鼠原位耐药脑胶质瘤的生长。ZOL@CNPs通过激活Caspase依赖的凋亡途径、抑制上皮间质转换、逆转耐药脑胶质瘤组织的免疫抑制微环境和缺氧微环境,诱导耐药脑胶质瘤细胞凋亡、减弱耐药脑胶质瘤细胞的侵袭能力,发挥显著的协同抗小鼠原位耐药脑胶质瘤作用。该项研究为构建脑胶质瘤靶向递药探索了新方法。