大肠埃希氏菌属于革兰氏阴性杆菌,俗称大肠杆菌。大多属于人肠道共生菌,一定条件下会引起肠道感染,有些特殊血清型具有致病性,严重的会引起败血症。大肠杆菌广泛存在于自然生态环境及医院、社区等各个社会环境中,有些病原性大肠杆菌对于免疫力低下的人群常引起严重流行性腹泻和肋膜炎等。抗生素发现以来,被广泛的应用到临床治疗中。然而,由于缺乏及时准确的大肠杆菌检测手段导致抗生素的滥用和误用,使临床上的大肠杆菌普遍出现耐药的情况。临床上很多抗生素已无法达到有效治疗的目的,治疗多耐药大肠杆菌感染变得十分艰难,这其中就包括了氨基糖苷类抗生素。而目前被认为是“金标准”的手工培养结合药敏实验的病原菌及耐药性检测的方法已逐渐无法满足临床的需求,十分耗时费力,难以快速诊断细菌感染并提供抗生素用药指导。临床检验中也有一些全自动检测仪器,但设备往往比较昂贵,难以在基层医疗机构推广。近年来,分子检测的方法以其检测精准、节省时间等优势逐渐被广泛接受。基于之前本实验室已有的鉴定肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌等病原菌的研究基础,我们针对大肠杆菌及几种典型的氨基糖类抗生素耐药基因建立了一套快速、准确的分子检测方法。该方法相比传统的培养学方法极大地缩短了检测所需的时间,对于临床快速选择合适的抗生素治疗起到关键作用。本研究主要用到的分子检测方法有PCR、LAMP、多重PCR及多重qPCR。首先,我们建立了大肠杆菌的快速检测方法。通过生物信息学手段筛选出一种假说蛋白基因(GenBank ID:13702648)作为大肠杆菌的特异基因。针对该特异基因分别建立了PCR和LAMP鉴定体系。用240株大肠杆菌及170株非大肠杆菌(铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺杆菌)样本进行特异性评估。经验证,两种方法均可特异的检测出大肠杆菌,无假阳性。同时,PCR和LAMP的检测方法均具备非常高的灵敏度,无论用阳性质粒还是菌液作模板其检测下限均可达到10~0个拷贝/反应。其次,我们还建立了氨基糖苷修饰酶耐药基因的检测方法。从耐药基因数据库(ARDB)中查找氨基糖苷修饰酶类耐药基因(ant、aac、aph),在NCBI数据库中下载得到三类耐药基因的全部亚型序列,对同类的耐药基因进行多序列比对,选择其共有的一段序列用于设计引物,其中aac设计两对引物分别用于扩增aac(6’)-I、aac(3)-II,ant和aph分别设计一对引物用于扩增ant(3’)和aph(3’)。初步构建出aac(6’)-I、aac(3)-II、ant(3’)和aph(3’)四个耐药基因检测的PCR方法,优化检测体系,进行灵敏度的评估。最后将构建的检测体系应用于实验室已有的240株大肠杆菌耐药临床株。结果表明,含有aac(6’)-I耐药基因的菌株有99株,检出率为41.08%;含有aac(3)-II耐药基因的菌株有155株,检出率为64.32%;含有ant(3’)耐药基因的菌株有53株,检出率为22.0%;含有aph(3’)耐药基因的菌株有40株,检出率为16.6%。实验检测结果与已知的大肠杆菌耐药表型符合率答93.75%,说明本次研究中建立的耐药基因检测体系结果较为准确,体现出分子检测方法的优势。此外同样的,对四个耐药基因的灵敏度进行评估时检测下限均达到个10~0拷贝/反应,证明了该方法具有高灵敏度。最后,利用四个氨基糖苷类耐药基因aac(6’)-I、aac(3)-II、ant(3’)和aph(3’)构建出四重PCR和四个qPCR反应体系。实验结果表明,四重PCR和qPCR耐药基因检测体系均可同时检测出这四个氨基糖苷修饰酶耐药基因,并且多重qPCR的检测方法耗时最短,仅需两个小时。本研究中成功挖掘出新的可用于大肠杆菌鉴定的特异基因,并对该基因构建了PCR和LAMP两种分子检测方法,这两种方法均可以快速、灵敏的检测出大肠杆菌。本研究还建立了氨基糖苷修饰酶类耐药基因的多重PCR和多重qPCR的检测方法,该方法不仅可用于检测大肠杆菌病原菌的耐药基因,还具备应用于其他病原菌中氨基糖苷修饰酶耐药基因的检测的潜力。