环氧合酶(cyclooxygenase,COX)是将花生四烯酸(AA)代谢为前列腺素(PGs)的关键限速酶。现已证实，COX至少存在三种异构酶，即结构型COX-1和诱导型COX-2以及最近发现的COX-3。COX-1广泛分布于各种组织，尤其是胃肠道、肾脏及血小板中，促进生理性PGs的合成，调节正常肾脏、胃肠道功能及维持血管内环境稳态，发挥“看家功能”。而COX-2在正常细胞中不表达或极少表达，刺激原如细胞因子、内毒素、炎症介质以及促癌剂等可显著上调该酶的表达。COX-3主要分布在脑和脊髓，其产生的PGD2参与介导痛觉和发热反应。已有的研究表明COX-2高表达于结肠癌、胃癌等恶性肿瘤组织。进一步研究显示选择性COX-2抑制剂可抑制动物模型胃癌的发生和发展以及多种消化道肿瘤细胞株的生长。而且长期应用非甾体类消炎药(NSAIDs)的人群中，大肠癌、胃癌等的发病率及死亡率较对照人群明显降低。提示COX-2的表达可能与胃肠道肿瘤的发生和发展密切相关。尽管目前NSAIDs尤其一些COX-2选择性抑制剂在消化道肿瘤防治中的作用已被广泛认可，但其作用机制尚未完全阐明。目前认为这种非COX-2依赖性途径可能包括以下分子机制：1)抑制PPARδ诱导肿瘤细胞的凋亡或激活PPARy抑制肿瘤细胞的生长，2)抑制IKKβ-NF-kB信号通路和3)抑制Akt信号通路等。 第一部分NSAIDs诱导COX/2不表达胃癌细胞凋亡目的：选择性COX-2抑制剂celecoxib和非选择性COX抑制剂indomethacin是否诱导COX-2不表达胃癌细胞株的凋亡。 方法：蛋白质免疫印迹检测细胞COX-2蛋白的表达，MTT法测定celecoxib和indomethacin对细胞存活率的影响，Hoechst33258染色，DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术分别检测celecoxib和indomethacin处理后细胞形态学改变，DNA断裂情况和DNA含量的变化。 结果： 1.胃癌细胞株AGS、HGC-27、BGC-823、SGC-7901和MGC-803均有COX-1的表达。COX-2在胃癌细胞株AGS、HGC-27和BGC-823中有高表达，而在SGC-7901和MGC-803中未见表达。 2.不同浓度celecoxib(10～100μM)和indomethacin(100～1200μM)处理MGC-803细胞12h、24h、48h后，细胞的存活率明显降低，其作用呈浓度和时间依赖性。100μMcelecoxib处理细胞12h、24h、48h后，细胞存活率分别为64.6±3.8％，46.1±2.8％，28.4±43.5％。1mMindomethacin作用于细胞12h、24h、48h后，细胞存活率分别为74.5±8.6％，52.2±3.4％，35.5±4.8％。 3.Hoechst33258核染色显示正常生长的MGC-803细胞的胞核呈弥散均匀荧光，核无固缩，呈现体积较大的浅染核形态；100μMcelecoxib和1mMindomethacin作用12h后细胞核形态不规则，呈现波纹状或折缝状，部分染色质出现浓缩状态；24h后细胞核的染色质高度凝集、边缘化；48h后，细胞核染色质裂解为块状，产生凋亡小体等典型的凋亡特征。 4.Celecoxib(100μM)和indomethacin(1mM)分别作用12h、24h和48h后，细胞DNA出现明显的梯状条带，即"DNAladder"。且随作用时间的延长，DNA断裂程度加重。 5.100μMcelecoxib分别作用12h、24h和48h后，各处理组均出现明显的凋亡峰。对照组细胞凋亡百分率为3.2±1.9％，celecoxib处理12h、24h和48h后各组细胞的凋亡百分率分别为24.5±4.3％(p＜0.01vscontrol，n=6)，52.7±5.6％(p＜0.01vscontrol，n=6)和80.6±8.2％(p＜0.01vscontrol，n=6)。 1mMindomethacin分别作用12h、24h和48h后各组细胞的凋亡百分率分别为22.6±3.5％(p＜0.01vscontrol，n=6)，42.8±6.1％(p＜0.01vscontrol，n=6)和61.6±9.7％(p＜0.01vscontrol，n=6)。而对照组细胞凋亡百分率为3.9±1.6％。 6.100μMcelecoxib和1mMindomethacin分别处理细胞12h、24h和48h后，caspase-3酶原被激活，蛋白免疫印迹显示17KDa的活化caspase-3片段。其作用存在时间依赖性。广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk100μM可完全抑制celecoxib和indomethacin引起的caspase-3酶原的活化。 7.Celecoxib(10-100μM)和indomethacin(100-1200μM)分别作用24h后，细胞存活率浓度依赖性降低。预先加入广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk100μM可部分逆转celecoxib和indomethacin的作用。 结论：1.COX-2并非表达于所有胃癌细胞。 2.Celecoxib和indomethacin均可通过COX-2非依赖性途径抑制胃癌细胞的生长、诱导胃癌细胞的凋亡。 3.Celecoxib和indomethacin引起的胃癌细胞凋亡包含caspase依赖性和caspase非依赖性凋亡通路。 第二部分NSAIDs通过Akt/GSK3β/NAG-1通路诱导COX/2不表达胃癌细胞凋亡目的：COX-2选择性抑制剂celecoxib和非选择性COX抑制剂indomethacin对Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平和NAG-1蛋白表达的影响以及PI3K/Akt/GSK3β信号通路在celecoxib和indomethacin影响NAG-1蛋白表达中的作用。 方法：蛋白质免疫印迹检测细胞蛋白的表达，MTT法测定GSK3β抑制剂对celecoxib和indmethacin降低细胞存活率的影响。 结果：1.在MGC-803细胞未检测到Thr308位点磷酸化Akt表达。选择性COX-2抑制剂celecoxib(100μM)和非选择性COX抑制剂indomethacin(1mM)分别作用于MGC-803细胞3、6、12小时后，总Akt蛋白表达无明显变化。Ser473位点磷酸化Akt的表达水平在3小时即明显降低。 2.Celecoxib(100μM)和indomethacin(1mM)分别作用于MGC-803细胞3、6、12小时后，细胞总GSK3β的表达无变化。Ser9位磷酸化水平在药物作用后3小时后开始下降，随作用时间的延长，其磷酸化水平逐渐降低。 3.10-100μMcelecoxib作用24h后，细胞存活率浓度依赖性降低。GSK3β抑制剂SB2167631μM预孵育1小时几乎完全逆转celecoxib降低细胞存活率的作用(Fig2-5A)。 100-1200μMindomethacin作用24h后，细胞存活率亦浓度依赖性降低。GSK3β抑制剂SB2167631μM预孵育1小时亦几乎完全逆转indomethacin的降低细胞存活率作用。 4.MGC-803细胞在基础状态下即有NAG-1蛋白的表达。Celecoxib(100μM)和indomethacin(1mM)分别作用6、12小时后，NAG-1的表达水平与对照组相比明显增加。 5.单独应用PI3K抑制剂LY294002(20μM)和Akt抑制剂1L-6-hydroxymethyl-chiro-inositol2(R)-2-O-octadecycarbonate(10μM)作用12小时后，NAG-1蛋白表达水平明显增加。预先加入GSK3β抑制剂SB216763(10μM)孵育1小时可完全取消PI3K抑制剂和Akt抑制剂诱导NAG-1表达的作用。 6.PI3K抑制剂LY294002(20μM)和Akt抑制剂(10μM)预孵育1小时后再加入100μMcelecoxib或1mMindomethacin，NAG-1的表达水平与单用celecoxib或indomethacin相比无差异。而预先加入GSK3β抑制剂SB216763(10μM)孵育1小时，则完全取消celecoxib或indomethacin诱导NAG-1表达的作用。 结论： 1.PI3K/Akt/GSK3β信号通路参与调控MGC-803细胞NAG-1的表达。 2.Celecoxib和indomethacin通过Akt/GSK3β/NAG-1信号通路诱导MGC-803细胞的凋亡。