依替米贝是目前调血脂药物市场的首个选择性胆固醇吸收抑制药物,而（4S）-3-[（5S）-5-（4-氟苯基）-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1,3-氧氮杂环戊烷-2-噁唑烷酮为其化学合成路线中的重要手性中间体,主要用于依替米贝的手性侧链的合成。依替米贝的化学法合成路线已有广泛报道,其中手性侧链的合成多采用手性噁唑硼烷催化合成,而以酶法手性不对称还原合成依替米贝手性中间体尚鲜见报道。因此,依替米贝手性中间体的酶法生产工艺有极为重要的研究和应用价值。本论文从实验室保藏的菌种中筛选到的高活力羰基还原酶表达菌株E.coli BL21 pET-28b-CR125,并进行发酵条件优化。构建和比较了异丙醇耦联体系和双酶耦联体系用于解决辅酶再生,催化合成依替米贝手性中间体,对反应体系有关工艺条件进行考察与优化。本论文研究内容包括:对羰基还原酶表达菌株CR125的摇瓶发酵条件进行优化,确定最适发酵条件:种子液培养时间10 h,LB培养基装液量100mL/500mL接种量2%,37°C,150 rpm下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8后,加入诱导剂IPTG至终浓度0.4 mM,28°C、150 rpm下诱导培养11 h,生物量达1.1 g DCW/L,体积酶活为31796.5 U/L,比酶活为30043.5U/g DCW。筛选了最适的发酵罐培养基配方进行5 L体系发酵罐发酵培养:蛋白胨20 g/L,酵母粉12 g/L、NaCl 10 g/L,甘油10 g/L,KH₂PO₄ 1.5 g/L,K₂HPO₄?3H2O 3.01 g/L,MgSO₄?7H₂O 0.25 g/L,pH7.0,灭菌后补加卡那霉素至终浓度为50.0μg/mL。发酵罐接种量8%,37°C,500 rpm下培养4 h,加入乳糖母液至终浓度为10 g/L,28°C,500 rpm下培养至10 h,生物量达10.4 g DCW/L,体积酶活为161960.5U/L,比酶活为14900.3 U/g DCW。利用CR125表达的羰基还原酶具有的醇脱氢酶活力,构建了异丙醇耦联体系实现辅酶再生,催化底物的不对称还原反应,确定最佳反应条件为:25 mL异丙醇与25 mL 0.1 M、pH 7.0 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶体系中,添加辅酶NADP⁺浓度150 mg/L,以10 g DCW/L CR125全细胞形式催化100 g/L底物,反应温度45°C下,12 h的转化率达91.4%,产物d.e.值始终维持在99.9%以上。本文筛选到对CR125和GDH6具有良好的生物相容性的对二甲苯作为最佳的两相组成有机溶剂,构建双酶耦联两相反应体系,在解决辅酶高效再生的同时实现对较高浓度底物的转化,具有很高的转化率和对映体选择性,确定最适反应工艺条件为:6 g DCW/L羰基还原酶表达菌株CR125和6 g DCW/L葡萄糖脱氢酶表达菌株GDH6构成双酶耦联,0.1 M、pH 7.5 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲盐溶液与等体积对二甲苯组成的两相体系,底物浓度150 g/L、反应温度35°C、不添加外源辅酶、葡萄糖摩尔添加量为底物1.2倍作为辅助底物,底物转化率达99.1%,产物d.e.值始终维持在99.9%以上。