论文部分内容阅读
背景和目的食管癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一,位于癌症相关死亡原因的第六位。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)与食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)是食管癌最常见的组织类型,我国主要以ESCC为主。目前,ESCC患者临床治疗主要包括手术、化疗与放疗。然而食管鳞癌患者的预后仍然很差,五年生存率低,对于晚期ESCC病人往往采用局部化疗和全身化疗的治疗手段。顺铂作为最常见的肿瘤化疗药物之一,可用于睾丸癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤的治疗。然而,在治疗的过程中,由于肿瘤本身固有的或在化疗过程中产生的获得性耐药,导致肿瘤化疗效果往往不佳。因此,阐明肿瘤耐药的分子机制可能为进一步提高临床化疗效果具有重要的意义。肿瘤细胞对顺铂产生耐药的原因包括:顺铂在细胞内的积累量减少、DNA修复能力增强和细胞内生物小分子或其他蛋白质导致顺铂失效等,其中顺铂在细胞内积累量减少是细胞对顺铂产生耐药的最主要原因。铜转运蛋白1(copper transporter 1,Ctr1)是一种不依赖ATP的跨膜转运体,主要定位于细胞膜上,是铜离子进入细胞的主要通道,同时也是细胞摄取顺铂的主要途径,控制着细胞对顺铂的敏感性。研究表明,过表达Ctr1可以增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性,相反敲除Ctr1基因会造成细胞对顺铂的摄取量减少,导致胞内顺铂浓度降低,进而增加细胞对顺铂的耐药性。这些结果提示Ctr1表达水平可能在评估顺铂的疗效中发挥重要作用,因而可能成为顺铂化疗评估的重要分子标记。为了探讨Ctr1在ESCC发生发展中的可能作用及其与顺铂敏感性的关系,在本研究通过以下两部分进行探讨,在第一部分中,我们首先通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析食管癌中Ctr1的表达,并采用半定量RT-PCR、原位杂交和免疫组化技术检测人ESCC组织和癌旁组织中Ctr1 mRNA和蛋白的表达,并分析其表达水平与ESCC患者临床病理学参数之间的关系,旨在探讨Ctr1在ESCC发生发展中的作用。第二部分通过下调和上调ESCC细胞中Ctr1的表达,分析其表达变化在介导ESCC细胞对顺铂敏感性中的作用,该研究旨在为Ctr1辅助临床评估ESCC病人的顺铂化疗效果提供实验证据。第一部分铜转运蛋白Ctr1在人食管鳞癌组织中的表达及其与临床病理学参数的关系方法1.利用TCGA数据库中的食管癌患者的数据集,获得Ctr1基因表达谱及其与临床病理学参数和预后之间的关系。2.采用半定量RT-PCR方法检测10例ESCC组织与癌旁组织中Ctr1 mRNA的表达。采用原位杂交和免疫组织化学技术检测108例ESCC组织及对应的癌旁组织中Ctr1 mRNA和蛋白的表达。采用SPSS21.0分析Ctr1 mRNA和蛋白的表达与ESCC病人临床病理学参数的关系。3.统计学分析:实验数据采用SPSS21.0软件进行统计学分析。半定量RT-PCR结果采用t检验,原位杂交和免疫组化的结果采用χ~2检验,Ctr1表达与食管癌病人预后之间的关系采用Log-rank检验分析差异,P<0.05表示具有统计学意义。结果1.TCGA数据库结果表明,Ctr1在食管癌中的表达显著高于正常组织,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。高表达Ctr1的食管癌病人的生存时间与中低表达Ctr1的食管癌患者相比,无统计学差异(P>0.05)。2.半定量RT-PCR结果表明,随机选择的10例ESCC组织中Ctr1 mRNA的相对表达水平显著高于癌旁组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。原位杂交和免疫组化结果显示,铜转运蛋白Ctr1 mRNA和蛋白在ESCC组织中阳性表达率(分别为65.7%和60.2%)显著高于癌旁组织(分别为32.4%和28.7%),两组之间差异具有统计学意义(P<0.0001)。3.Ctr1表达与ESCC患者的年龄和性别无关(P>0.05),但与ESCC患者的组织学分级、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。第二部分铜转运蛋白Ctr1在介导ESCC细胞对顺铂敏感性中的作用方法1.采用qRT-PCR与Western blot技术检测ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109、Kyse450、EC1、TE1及正常食管上皮细胞Het-1A中Ctr1 mRNA与蛋白的表达。2.不同浓度顺铂(0.5μg/ml、2.0μg/ml和4.0μg/ml)处理Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450细胞48h后,采用Western blot检测ESCC细胞中Ctr1蛋白的表达。3.构建Ctr1过表达载体pcDNA3.1-Ctr1,将对照siRNA(si-Con)和Ctr1siRNA(si-Ctr1)以及pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-Ctr1转染Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450细胞,采用qRT-PCR与Western blot技术检测转染后ESCC细胞中Ctr1 mRNA和蛋白的表达。4.利用CCK-8法检测si-Ctr1或pcDNA3.1-Ctr1联合顺铂对ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450存活率的影响。5.利用FITC/PI双染法检测si-Ctr1或pcDNA3.1-Ctr1联合顺铂对ESCC细胞Kyse70、EC9706、ECa109与Kyse450凋亡的影响。6.利用Transwell小室检测si-Ctr1或pcDNA3.1-Ctr1联合顺铂对ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450迁移与侵袭的影响。7.统计学分析:实验数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析,对于多个样本的比较采用单因素方差分析(One way ANOVA),两组之间比较采用t检验,P<0.05表示具有统计学意义。结果1.ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109、Kyse450、EC1和TE1中Ctr1 mRNA和蛋白的表达量显著高于正常食管上皮细胞Het-1A(P<0.01)。2.不同浓度的顺铂处理48h后,ESCC细胞中Ctr1蛋白的表达量明显下调,并且呈现明显的剂量依赖性。不同浓度的顺铂处理后,ESCC细胞中Ctr1蛋白的表达量明显下调,并且呈现明显的剂量依赖性。3.与si-Con组相比,si-Ctr1转染组的ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450中Ctr1的mRNA与蛋白的表达量显著下调(P<0.01),而未处理组与si-Con组之间Ctr1 mRNA与蛋白的表达无差异(P>0.05)。4.CCK-8结果表明,si-Ctr1联合顺铂组中Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450的存活率明显高于si-Con联合顺铂组(P<0.01)。5.细胞凋亡结果表明,si-Ctr1联合顺铂组ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450的凋亡率明显低于si-Con联合顺铂组(P<0.01)。6.Transwell结果表明,si-Ctr1联合顺铂组ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450的迁移和侵袭的细胞数明显高于si-Con联合顺铂组(P<0.01)。7.与pcDNA3.1联合顺铂组相比,pcDNA3.1-Ctr1组中ESCC细胞Kyse70、EC9706、Eca109与Kyse450的存活率明显降低,凋亡率明显升高,细胞迁移与侵袭的数目明显减少,且差异均有统计学意义(P<0.01)。结论1.铜转运蛋白Ctr1在ESCC组织中呈高表达,它的高表达与ESCC患者的组织学分级、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移密切相关,提示Ctr1可能参与ESCC的发生与发展过程。2.Ctr1表达下调降低ESCC细胞对顺铂的敏感性,抑制顺铂诱导的ESCC细胞的凋亡和增强顺铂介导的ESCC细胞的迁移与侵袭能力。3.Ctr1表达上调增加ESCC细胞对顺铂的敏感性,促进顺铂诱导的ESCC细胞的凋亡和抑制顺铂介导的ESCC细胞的迁移与侵袭能力。