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目的和意义:急性白血病是一种发生于造血干细胞的高异质性及高死亡率的恶性克隆性疾病。根据现有的临床研究资料显示,约8%的AML患者存在EVI1基因的高表达,并且预示着不良预后且治疗过程中对化疗药物不敏感。EVI1基因所处的3q26易产生染色体的断裂,并形成t(3;21)(q26;q22)Runx1-EVI1(AML1-EVI1)融合基因,通过多种途径引起下游造血的改变进而诱导白血病的发生及发展。虽然多年来国内外有许多学者致力于研究EVI1单基因的作用,但它对造血的影响还知之甚少,并且EVI1基因、AML1基因与AML1-EVI1融合基因的作用关系与差异更鲜有研究。因此本研究在体外利用白血病人细胞株探究EVI1对造血调控因子的影响,在体内建立转基因EVI1与转基因AML1斑马鱼品系,研究上述基因对造血的调控,并探讨白血病治疗药物三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)在体内外对造血因子调控的影响。最后根据实验中的发现,探讨了临床上常用的化疗药物阿霉素(Doxorubicin,DOX)的心脏毒性与其保护剂右丙亚胺(Dexrazoxane,DZR)的作用与机制,为临床上个体化合理治疗白血病提供了理论依据及新的思路。实验方法:体外实验选取EVI1基因高表达的急性髓系白血病细胞株THP-1,利用健康成人外周血单个核细胞作为对照,通过逆转录-实时定量荧光聚合酶链式反应(RFQ-PCR)检测EVI1基因及造血转录因子GATA1、GATA2、RUNX1、MPO、LM02、C-MYB、PU.1与SCL的mRNA相对表达量。之后分别以1μM、3 μ M、5 μ M的ATO溶液处理THP-1细胞株,并再次利用RFQ-PCR检测EVI1基因及造血转录因子的mRNA相对表达量。体内实验利用人源AML1-EVI1融合基因中的AML1基因及EVI1基因构建携带绿色荧光蛋白报告基因的质粒To12-AML1与To12-EVI1,分别显微注射至单细胞期斑马鱼胚胎中,筛选成功表达目的基因的F0代(Founder)并将其培养至性成熟,并与AB系野生型斑马鱼(WT)交配产卵后产生 F1 子代(分别为 To12-EVI1-EGFP:TE;To12-AML1-EGFP:TA)。经鉴定成功表达相应目的基因的转基因斑马鱼品系中与野生型斑马鱼对照,在斑马鱼发育至1dpf、3dpf与7dpf时检测上述造血转录因子的表达。在斑马鱼胚胎发育至18hpf时分别加50 μ M与100 μ M的ATO溶液,在同样斑马鱼发育至1dpf、3dpf与7dpf时检测相同造血转录因子与EVI1基因的表达变化。最后,本研究选择24hpf的AB品系野生型斑马鱼胚胎,分别暴露于0,1.84μM,18.40μM,36.80μM,46.00μM,55.20μM,64.40μM,73.60μM,82.79μM,91.99μM阿霉素中,选择心脏毒性表型明显的阿霉素浓度64.40μM,联用或不联用右丙亚胺48h,右丙亚胺浓度分别为130.47μM,260.93μM。在斑马鱼胚胎发育至72hpf时显微镜观察心血管系统形态学改变,记录心率变化。并分别抽提斑马鱼胚胎RNA检测心脏发育相关基因及氧化、抗氧化相关指标。结果:本实验在体外利用高表达EVI1基因的细胞株THP-1与正常人单核细胞通过RFQ-PCR的方法证实EVI1基因在体外可上调GATA2与CMYB基因的表达,并下调GATA1、RUNX1、MPO、LM02、PU.1与SCL基因的表达水平。并且,ATO对EVI1基因的下调作用有着浓度依赖性与时间依赖性,对于其他转录因子皆有下调作用。另外,体内实验部分,本实验成功构建了高表达人源EVI1与截短型AML1基因的转基因斑马鱼品系TE与TA,并培养到F1代。实验证实EVI1基因高表达的斑马鱼有很严重的表型,并且对上述转录因子的表达水平均有不同程度的影响。ATO处理的TE品系斑马鱼可以降低EVI1基因的表达,并减轻其对GATA2的上调。对于药物心脏毒性部分的研究发现随着阿霉素浓度的升高,斑马鱼出现了如胚胎发育畸形、心包水肿等改变且死亡率升高,联用右丙亚胺组可有效挽救阿霉素对斑马鱼心脏的毒性作用并显著提升胚胎生存率。联用130.47μM、260.93μM右丙亚胺分别将存活率由35%提升至90%、88.3%(p<0.001)。通过 RT-PCR 检测心脏发育相关基因 nkx2.5、cmlc2、amhc、vmhc,未发现显著改变。对氧化抗氧化指标的检测发现66.40μM浓度阿霉素可致斑马鱼胚胎MDA水平显著上升(p<0.001),SOD活性明显下降(p<0.001),右丙亚胺可有效清除MDA并恢复SOD活性。结论:本实验通过体外与体内的方法,选择与构建了EVI1基因高表达的模型,发现EVI1基因可以上调GATA2的表达,并间接影响其他造血转录因子促进原始细胞增殖并对髓系、红系的分化成熟起抑制作用。ATO可特异性下调EVI1基因的表达并减轻GATA2转录因子的激活。并且成功建立了斑马鱼评价心脏毒药物的模型。