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银屑病(psoriasis)是一种常见的以角质形成细胞增生分化异常为主要表现的慢性炎症性皮肤病,发病率高,病程长,病情顽固,易复发。临床主要皮损特征是境界清楚的各种形态的红色斑丘疹、斑块,表面覆以银白色鳞屑.其病理特点是表皮角质形成细胞的过度增殖、分化不全以及真皮毛细血管的增生。当前银屑病的病因和发病机制尚未完全阐明,大多数学者认为银屑病是一种多基因遗传背景下的T细胞性的自身免疫性疾病,皮损内T淋巴细胞的活化和细胞因子的释放在银屑病的发病和维持其基本病理特征方面起关键性作用。消银解毒饮是东直门医院皮肤科治疗银屑病的自制方剂,多年来取得了良好的临床疗效,近年我科众位医生采用最前沿的中西医科学技术,研究其治疗银屑病的疗效机理等也取得了一定的进展。
目的:
1.研究消银解毒饮对血热证型银屑病患者外周血淋巴细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ的调控作用,揭示其对外周血淋巴细胞调控作用的实质内涵及方药治疗银屑病的细胞分子免疫学调控机制。
2.通过对消银解毒饮及其组方的实验研究比较,揭示其治疗银屑病的组方配伍规律,为中医药辨证组方治疗疾病提供科学依据和新的思路方法。
方法:
1.外周血淋巴细胞(PBMC)的分离:采用随机,对照原则,将入选血热型银屑病患者与正常对照组健康人分别抽取静脉血,进行外周血淋巴细胞的分离。
2.动物血清药制备:取五十只清洁大鼠随机分为五组,消银解毒饮组、凉血方组、凉血解毒方组、甲氨蝶呤阳性对照组及蒸馏水空白对照组,每组十只,分别给药灌饲后,腹主动脉取血,分离血清,灭活分装备用。
3.人永生化角质形成细胞(Hacat细胞)与人外周血淋巴细胞混合接种及培养:以完全培养液将对数生长期的人永生化角质形成细胞调成5×104/ml,接种于96孔培养板,每孔100ul,再加入外周血淋巴细胞7000个/每孔,采用含10％胎牛血清,100(u)/ml的青、链霉素的MEM培养基,置于37℃、5％CO,培养箱混合培养。
4.四唑盐(MTT)比色实验测定药物对人永生化角质形成细胞增殖率的影响:混合培养细胞24小时后,加入已制备的5种不同的动物血清药物,每一种药物分为4个体积分数组(每一组设9个复孔),分别加入体积分数为2.5％、5％、7.5％、10％的含药血清100ul,并设蒸馏水组为空白对照组,用酶标仪检测492nm处的吸光度值(OD值)。实验重复3次,结果以-X±SD表示,资料用SPSS16.0软件进行统计学处理。
5.双抗体夹心ABC-ELISA法测定药物对外周血淋巴细胞分泌IL-4,IFN-γ的影响:用抗人IL-4、IFN-γ单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的与单抗结合,加入生物素化的抗人IL-4、IFN-γ抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,可通过绘制标准曲线求出标本中IL-4,IFN-γ浓度。取混合培养48小时细胞上清液,采用检测试剂盒,分析其分泌量。统计学分析,分析组间差别,结果以-X±SD表示,资料用SPSS16.0软件进行统计学处理。
结果:
1.消银解毒饮能调控人外周血淋巴细胞分泌某些细胞因子,促进其分泌IL-4(P＜0.05),抑制其分泌IFN-γ(P＜0.05),从而对人永生化角质形成细胞的活化增殖,发挥有效的抑制作用.凉血类药物可能在促进淋巴细胞分泌IL-4方面起主要作用,解毒类药物可能在抑制淋巴细胞分泌IFN-γ方面起主要作用。
2.消银解毒饮能有效地抑制人永生化角质形成细胞的增殖,诱导其凋亡,从而降低异常增生细胞的存活率(P＜0.05),疗效显著优于单组中药,且药理血清的浓度与角质细胞增殖呈负相关,药理血清越增大,对其增殖的抑制越显著。
3.细胞形态学观察:在混合细胞培养板中加入药理血清作用48 h后,含药血清各剂量组在光镜下均可观察到细胞的生长受到不同程度的抑制,单位面积数目减少、细胞变圆、变小、漂浮。
4.通过上述实验结果分析,消银解毒饮治疗血热证型银屑病的治疗内涵,可能是抑制银屑病T淋巴细胞介导恶性循环的发病机制,即抑制T细胞活化,由抑制活化T细胞产生淋巴因子来抑制表皮角质细胞增殖,而抑制增殖角质形成细胞又可以反过来调控释放细胞因子来减弱活化T细胞作用,从而打破T细胞介导的恶性循环,对治疗银屑病取得较好的临床效果。