第一部分宫颈癌中HPV16感染与ERK1/2信号通路表达的关系研究目的:宫颈癌是世界上第二常见的癌症类型,也是全球女性癌症相关死亡率的第六大主要原因。宫颈癌每年每10万人中约有16名女性感染,每年每10万人中约有8人死于该病。早期宫颈癌可以通过切除或破坏癌前组织或癌组织来治愈。然而,一旦癌细胞转移到远处的器官,病人的预后就会大大受损。宫颈癌的标准治疗包括手术、化疗和放射治疗。这些治疗对邻近或远处的正常组织造成伤害或损害,并可能促进癌细胞的侵袭和转移。宫颈癌转移可能导致传统治疗的失败,包括手术、放疗和化疗。人乳头状瘤病毒(HPV)是世界上最常见的性传播感染,虽然大多数病毒相对无害,但有些病毒如HPV16会增加妇女患宫颈癌的风险。ERK是一种细胞外调节蛋白激酶,参与许多细胞程序。ERK从细胞质到细胞核的磷酸化活化,参与细胞的生物学反应。因此,这些研究表明,需要探讨人乳头瘤病毒16(HPV16)感染与宫颈癌细胞外信号调节激酶(ERK1/2)信号通路表达的关系,以找寻新的和更有效的治疗宫颈癌的方法。患者和方法:本研究选取2016年3月至2018年3月入院(苏州大学附属第二医院和上海交通大学附属第九人民医院奉城分院)的163例宫颈癌患者作为研究对象,同期非宫颈癌受试者163例作为对照研究对象。用HPV DNA分型检测宫颈癌患者和非宫颈癌患者的HPV16阳性率,根据入组标准和排除标准选择宫颈癌标本30例(宫颈癌组)和非宫颈癌标本23例(非宫颈癌组),IHC染色法检测宫颈癌组和非宫颈癌组的ERK1/2表达,定量实时聚合酶链反应(q RT-PCR)和蛋白质印迹法检测ERK1/2(ERK1/2信号通路的关键基因)的转录和翻译水平。结果:(1)宫颈癌患者中HPV16阳性率为81.5%,非宫颈癌患者中HPV16阳性率14.1%,宫颈癌患者中HPV16阳性率明显高于非宫颈癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。ERK1/2在宫颈癌组呈强阳性表达,阳性率明显高于非宫颈癌组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)qRT-PCR结果显示,HPV16阳性宫颈癌标本中ERK1/2的转录和翻译水平明显高于非宫颈癌组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)Western blotting结果显示,HPV16阳性宫颈癌标本中ERK1/2的转录和翻译水平明显高于非宫颈癌组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HPV16可通过激活ERK1/2信号通路促进宫颈癌细胞增殖,从而促进宫颈癌的恶化,两者具有一定的相关性。第二部分抑制HPV16与ERK1/2信号通路表达的关系研究目的:从第一部分的实验当中得出HPV16可通过激活ERK1/2信号通路促进宫颈癌细胞增殖,从而促进宫颈癌的恶化。那么,需要探讨抑制人乳头瘤病毒16(HPV16)感染与宫颈癌细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路表达的关系,试图寻找以ERK1/2为切入点的新的治疗宫颈癌的方法,达到精准医疗。患者和方法:选择HPV16阳性的宫颈癌Si Ha细胞作为研究的对象。用RNA干扰法抑制HPV16基因的表达,形成干预组和对照组,荧光q RT-PCR和Western blotting检测ERK1/2的转录和翻译水平,用细胞计数试剂盒-8(cck-8)法测定细胞活力。在宫颈癌Si Ha细胞中加入ERK1/2抑制剂U0126,形成对照组和干预组,观察Si Ha细胞的增殖和形态。结果:(1)通过q RT-PCR和Western blotting检测HPV16阳性Si Ha细胞在RNA干扰前后的转录和翻译水平,ERK1/2在HPV16干扰前的转录和翻译水平明显高于HPV16干扰后的转录和转化水平,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)在CCK-8细胞活力测定中发现,抑制HPV16后能明显降低细胞活力,细胞增殖明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)加入ERK1/2抑制剂后,Si Ha细胞的细胞活力明显下降,增殖和粘附生长能力均明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:抑制HPV16可抑制ERK 1/2信号通路,抑制HPV16和ERK1/2可以降低细胞活力。第三部分ERK1/2对宫颈癌细胞生物学功能的影响目的:子宫颈癌是影响妇女健康的主要癌症疾病之一,其中,HPV16感染是引起子宫颈癌发生的主要病因,大量研究证实还有许多生物学信号在子宫颈癌中发现。研究表明,丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路也同时存在于肿瘤细胞中,并对肿瘤细胞的发生发展具有重要的影响,在MAPK大家族中,细胞外信号调节激酶(ERK)是一类重要的因子,可以将细胞外信号传递到细胞核,同时还具有磷酸化核转录因子的作用,进而影响肿瘤细胞相关因子的表达。大量研究已经指出,在子宫颈癌细胞中,ERK1/2的表达明显,并且具有随着病变程度呈正比例变化趋势,但究其原因仍不得而知。因此,本研究采用体外细胞实验的方法进一步探讨了ERK1/2在子宫颈癌细胞中对核转录因子的调控作用,以明确ERK1/2在子宫颈癌发生发展过程中的可能机制。方法:本部分以HPV16阳性的Si Ha子宫颈癌细胞为研究对象,采用ERK1/2抑制剂U0126对子宫颈癌细胞进行干预处理,从而形成干预组和对照组,干预组采用U0126干预处理,对照组未采用U0126干预处理。采用细胞计数的方式检测细胞的生长情况,采用CCK-8法检测细胞活性,采用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;采用RT-PCR法检测相关核转录因子m RNA表达情况;采用Western-blot法检测相关核转录因子蛋白表达水平,最后采用SPSS软件对所采集的数据进行统计学处理和分析。结果:(1)对照组中,Si Ha子宫颈癌细胞呈上皮型贴壁生长,细胞增殖较快,细胞轮廓清晰,悬浮细胞较少,相比而言,干预组细胞增殖较慢,并且悬浮细胞较多,细胞呈现不规则变化;(2)与对照组相比,干预组细胞数不断降低,而对照组细胞数先增加后降低,二者变化趋势差异显著,具有统计学意义(P<0.05),此外,结果还显示,ERK1/2抑制剂添加后,Si Ha子宫颈癌细胞的抑制率达到98.54%;(3)与对照组相比,干预组的细胞增殖指数显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001);此外,与对照组相比,Si Ha子宫颈癌细胞干预组细胞数处于G0/G1比例较高,处于S期比例较低,差异具有统计学意义(P<0.001);(4)与对照组相比,Si Ha子宫颈癌细胞干预组的凋亡显著增加,二者差异显著,具有统计学意义(P<0.05),此外,与对照组相比,干预组的细胞凋亡率显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);(5)与对照组相比,干预组的hn RNP E1 m RNA表达量和hn RNP E1蛋白表达水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(6)与对照组相比,干预组的c-Fos m RNA表达量和c-Fos、p-c-Fos蛋白表达水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(7)与对照组相比,干预组的c-Jun m RNA表达量、c-Jun以及p-c-Jun蛋白表达水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)ERK1/2的活化可以降低子宫颈癌细胞的凋亡,促进子宫颈癌细胞的增殖分化;(2)ERK1/2对子宫颈癌细胞中hn RNP E1的表达具有重要的调节作用,这种调节作用可能也有HPV16感染的协同参与;(3)ERK1/2可以激活子宫颈癌细胞中c-Fos和c-Jun因子,从而影响子宫颈癌细胞的发生和发展,在此过程中,HPV16感染也可能协同参与。