目的:　　 1.获取人C16orf68基因全长CDs,构建原核表达载体,诱导重组蛋白表达,获得纯度较高的C16orf68重组蛋白。　　 2.制备兔抗C16orf68重组蛋白多克隆抗体。　　 3.观察C16orf68基因表达产物在HepG2细胞内的亚细胞定位。　　 4.观察C16orf68在正常和病理组织以及细胞内的分布和表达特征。　　 5.构建pcDNA3.1(-)-C16orf68真核表达质粒及pcDNA6.2-C16orf68shRNA干扰质粒,为该基因功能的研究奠定基础。初步观察C16orf68表达变化对HepG2细胞细胞周期的影响。　　 方法:　　 1.采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)技术,以从人肝星状细胞系LX2细胞中提取的总RNA为模板,逆转录成cDNA,以cDNA为模板扩增C16orf68基因编码区CDs,构建原核表达质粒pET-32a(+)-C16orf68中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,免疫印迹(Western blot)分析重组蛋白表达的特异性,质谱检测目的蛋白表达的正确性。　　 2.用C16orf68的重组蛋白对新西兰大白兔进行免疫,获得兔抗C16orf68重组蛋白的多克隆抗体,并通过WesternBlot技术和ELISA方法检测多克隆抗体的特异性及效价。　　 3.构建C16orf68荧光蛋白融合蛋白表达质粒,与已知内质网驻留蛋白calreticulin-荧光蛋白融合蛋白表达质粒共同转染HepG2细胞,利用激光共聚焦技术观察C16orf68在HepG2细胞内的定位。　　 4.利用制备的多克隆抗体,采用免疫组化染色,初步观察C16orf68基因表达产物在不同组织以及不同细胞内的分布和表达特征。　　 5.利用密度梯度离心技术分离纯化不同人群的外周血单个核细胞(PBMC)。利用磁珠分选技术纯化PBMC中的CD4+T和CD8+T细胞亚群。裂解细胞提取总蛋白,观察不同亚群细胞中C16orf68基因表达变化特征。　　 6.构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-C16orf68,通过实时荧光定量PCR技术筛选有效的pcDNA6.2-C16orf68shRNA干扰质粒,转染HepG2细胞,应用流式细胞术初步观察C16orf68的表达变化对HepG2细胞细胞周期的影响。　　 结果:　　 1.扩增获得了C16orf68基因片段,构建了原核表达质粒pET-32a(+)-C16orf68,测序结果正确,成功表达了C16orf68重组蛋白,免疫印迹(Westernblot)分析及质谱鉴定C16orf68重组蛋白正确。　　 2.制备的兔抗C16orf68多克隆抗体,免疫印迹(Westernblot)分析多克隆抗体的特异性良好,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价＞1:80000。　　 3.成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1-C16orf68,与已知的内质网驻留蛋白pDsRED-N1-Calreticulin共同转染HepG2细胞,激光共聚焦观察显示两者不存在共定位象,C16orf68主要定位在细胞质,在细胞核内有少量表达。　　 4.通过免疫组化染色,初步观察到C16orf68蛋白在肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结组织中均表达,在肝癌组织中的表达强于慢性乙型肝炎组织,Western Blot分析表明,C16orf68在不同人群PBMC中的不同细胞亚群表达不同,肝炎患者CD4+T细胞和CD8+T中的表达高于较正常人,而艾滋病患者的CD8+T和非T淋巴细胞中该蛋白表达显著高于正常人。　　 5.成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(-)-C16orf68,筛选出了有效的干扰质粒pcDNA6.2-C16orf68shRNA-1,转染HepG2细胞,结果初步显示,C16orf68表达上调可以延长细胞周期的S期,而C16orf68低表达S期部分下调,提示C16orf68可能促进HepG2细胞增殖。　　 结论:　　 1.成功构建了原核表达质粒pET-32a(+)-C16orf68,诱导获得了高纯度的C16orf68重组蛋白,质谱分析鉴定表达的C16orf68蛋白正确。　　 2.制备的兔抗C16orf68多克隆抗体具有较好的特异性,ELISA检测证实该抗体效价＞1:8000为进一步研究C16orf68的生物学功能奠定了基础。　　 3.C16orf68与内质网驻留蛋白pDsRED-N1-Calreticulin在HepG2细胞中不存在共定位现象,C16orf68定位在细胞质,在细胞核内有少量表达。　　 4.免疫组化染色表明,C16orf68蛋白在肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结及脾脏中均表达,在肝癌组织中的表达强于慢性乙型肝炎组织的表达。　　 5.通过流式细胞术检测初步表明,C16orf68表达上调有促进HepG2细胞的增殖的趋势。　　 6.与正常对照人群相比,慢性病毒感染过程中患者外周血不同T细胞亚群表达存在不同的变化特征,C16orf68在免疫细胞中表达变化的意义及作用还有待进一步的研究。