论文部分内容阅读
食源性致病菌是导致食物中毒和食源性疾病爆发等食品安全问题的重要因素。全球范围内由食源性致病菌引起的疾病的高发病率导致了患者的高死亡率。因此,为了对食品安全进行有效的保证,人们迫切需要寻找一种更好的方法来对致病菌进行快速、准确的检测。检测食源性致病菌的方法有标准方法和快速检测方法两大类,标准方法具有准确、稳定的优点,但其也有操作复杂,耗时长等缺点。因此,各种现代快速检测技术应运而生,如以微量生理生化反应为基础的数码分类鉴定法、以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）为代表的分子生物学法和以酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和胶体金标记等为代表的各类免疫标记技术,这些方法都各有优点和不足。因此,多学科新知识、新材料和新技术交叉融合来构建性能更优的新型快速检测技术是该领域的发展趋势。免疫比色法由于具有简便、灵敏、信号产生迅速和裸眼可观测结果等优点而成为最重要的分析方法。免疫比色法的反应结果可以通过肉眼观察或者借助于基础光学仪器测得,且已广泛用于现场检测。便携式电流型葡萄糖传感器（简称血糖仪,Personal glucose meters,PGM）具有经济实用、微型便携、操作简便、快速准确等优点,已经广泛应用于家庭和临床的血糖监控,然而将其用于食源性致病菌检测的研究却少之又少。因此,将具有如此突出优点的血糖仪检测技术应用到食源性致病菌检测领域,具有显著的创新性和广阔的应用前景。为充分利用PGM检测技术和免疫比色法的优势,打破目前应用领域的局限性,本研究首先研发了4种信号转导探针,并结合免疫磁性纳米材料特异性富集和分离克罗诺阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii,C.sakazakii）和大肠杆菌 O157:H7（Escherichia coli O157:H7,E.coli O157:H7）两类模型菌株;用葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,GOx）和蔗糖酶（Invertase）作为信号转导探针的转化元件,用PGM将目标食源性致病菌的种类和数量与体系中葡萄糖浓度变化结合起来,从而实现对非葡萄糖类目标物的检测。用生物素亲和素系统标记辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）作为信号放大与转导探针,将目的菌信号转化为酶标仪能检测的光学信号,结合免疫磁性捕获分离探针,创建了一类具有快速、准确、便携、灵敏等优点的致病菌定性和定量检测新方法。具体的研究工作如下:1、GOX-SiNPs-IgG信号转导探针结合PGM免疫夹心法快速检测C.sakazakii本研究合成制备了抗克罗诺阪崎肠杆菌抗体和GOx偶联的二氧化硅纳米粒子（Antibodies against C.sakazakii and GOx conjugated silica nanoparticles,IgG-SiNPs-GOx）作为信号转导探针,再结合磁性信号识别探针,构建了一种基于IgG-SiNPs-GOx和PGM的酶免疫夹心快速检测法。本研究中改进合成了两种纳米粒子并功能化:通过化学共沉淀法合成四氧化三铁磁核心并包覆二氧化硅外壳制备出磁性纳米粒子（Magnetic nanoparticles,MNPs）,再通过硅烷偶联剂氨基化和戊二醛醛基化对MNPs进行表面基团修饰活化,继之偶联抗体,制成抗C.sakazakii抗体偶联的磁性纳米粒子（Antibodies against C.sakazakii conjugated magnetic nanoparticles,MNPs-IgG）;采用反向微乳液法合成二氧化硅纳米粒子（Silica nanoparticles,SiNPs）,采用戊二醛法对SiNPs进行表面修饰,将抗体和葡萄糖氧化酶（GOx）分别偶联到SiNPs的表面。夹心结构形成过程如下:首先捕获探针MNPs-IgG与C.sakazakii孵育形成MNPs-IgG-C.sakazakii免疫复合物,再加入IgG-SiNPs-GOx形成免疫夹心复合物,经磁性分离、洗涤,再加入葡萄糖溶液。通过夹心结构中的GOx分解葡萄糖导致体系中葡萄糖浓度的变化,再用PGM进行测定。在最佳检测条件下,其线性范围为 9.0×102 CFU/mL到 9.0×107 CFU/mL,检测限为 4.2×101CFU/mL（S/N=3）。2、IgG-Biotin-Avidin-HRP信号转导探针结合免疫比色法快速检测C.sakazakii为建立一种更好的C.sakazakii新型免疫比色法,本研究用MNPs-IgG作为捕获探针分离和富集目的菌并结合生物素-亲和素系统及HRP触发的显色反应来实现快速检测C.sakazakii的目的。利用生物素标记抗 C.sakazakii抗体（Biotin labeled anti-C.sakazakii,Biotin-IgG）和亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin labeled HRP,AviDin-HRP）（IgG-Biotin-Avidin-HRP）作为信号转导探针,将目的菌信号转化为酶标仪能定量分析的光学信号。本章首先通过溶剂热法（Solvothermal method）合成磁性四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4 nanoparticles）,再利用St（?）ber法在表面包覆二氧化硅,接着进行硅烷化使表面接上氨基,再与活化羧基的抗体进行偶联。当存在C.sakazakii时,由MNPs-IgG开始捕获,再通过免疫夹心法一步步结合上作为信号转导探针的Biotin-IgG和Avidin-HRP。经磁性分离后催化氧化底物四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）,经硫酸终止反应后体系颜色从蓝色变成黄色,用酶标仪测得有色产物的吸光度值与C.sakaziaki浓度的对数成比例关系。在最优检测条件下,线性范围为8.1×103 CFU/mL到8.1×107 CFU/mL,检测限为8.68×1 02 CFU/mL（S/N=3）。3、IgG-Biotin-Avidin-Invertase信号转导探针结合PGM免疫夹心法快速检测C.sakazakii基于上述研究证明生物素亲和素系统结合免疫夹心法能够很好地对C.sakazakii进行检测。为更好地实现简便和经济的检测目的,本章研究将检测仪器从酶标仪换成便携经济的PGM,将信号转导探针中的HRP换成Invertase,即亲和素标记蔗糖酶（Avidin labeled Invertase,Avidin-Invertase）,使信号的产生方式也发生了改变,将体系中的目标菌信号转化为葡萄糖分子信号。当样品中存在C.sakazakii时,先通过MNPs-IgG进行捕获分离,再结合Biotin-IgG和Avidin-Invertase 形成信号转导探针 IgG-Biotin-Avidin-Invertase,进一步形成免疫夹心复合物,再向反应体系中加入蔗糖溶液,通过使用PGM测定由蔗糖酶水解蔗糖产生的葡萄糖浓度,从而实现对C.sakazakii的检测。在最佳检测条件下,葡萄糖浓度和C.sakazakii浓度的对数值呈线性关系,线性范围为8.1×102 CFU/mL到8.1×107 CFU/mL,检测限为 2.03×102 CFU/mL（3σ）。4、Ab2/APSNPs/Invertase信号转导探针结合PGM免疫夹心法快速检测E.coli O157:H7本研究构建了一种新型信号转导探针并结合PGM检测E.coli 0157:H7的免疫夹心法。先用两步法合成金-铂纳米粒子（Au-Pt Nanoparticles,Au-Pt NPs）,同采用 St（?）ber 法合成 SiNPs,经过硅烷化修饰上氨基,两者再通过静电吸附作用和Au-N/Pt-N键形成金-铂/二氧化硅纳米颗粒（Au-Pt/SiO2 Nanoparticles,APS NPs）。再把该复合物作为载体,同时标记抗E.coli 0157:H7抗体和蔗糖酶,获得具有免疫活性的Ab2/APSNPs/Invertase作为信号转导探针。先用修饰了抗 E.coli O157:H7 抗体的 MNPs-IgG,对样品中的E.coli 0157:H7进行捕获、富集、分离后,再与Ab2/APSNPs/Invertase进行孵育结合,得到免疫夹心复合物,用PGM测量反应体系中由蔗糖酶水解蔗糖产生的葡萄糖浓度,再将葡萄糖浓度和E.coli O157:H7浓度联系起来。在最佳检测条件下检测的线性范围是3.5×102到3.5×108 CFU/mL,检测限为 1.83×102CFU/mL（3σ）。综上所述,本论文构建了 4种不同的快速检测方法来实现对致病菌的检测。4个方法都展现了其独特的优势,且都具有良好的灵敏度、特异性和稳定性,但也有各自的不足需要后期不断的研究与改进。