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新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）可引起禽类的急性、高度接触性、致死性传染病，给养禽业生产和发展造成严重的危害，也给社会带来巨大的经济损失。长期以来NDV疫苗均是通过鸡胚生产，但这种传统方法具有成本较高、工作量较大等缺点。干扰素系统是宿主抵抗病毒进入机体和阻止病毒在机体增殖的第一道防线，NDV通过“RNA编辑”产生的V蛋白具有阻断IFN抗病毒活性功能。近年来已有研究应用V蛋白拮抗干扰素功能的方法在细胞增殖新城疫病毒，但其增殖效果不甚理想。究其原因可能有：V蛋白表达不稳定和表达量不高、不同细胞株的选择、不同株NDV V蛋白表达的选择等。本实验选取外源基因在染色体上可持续稳定高效表达的PiggyBac转座子系统，构建稳定表达NDV La Sota株V蛋白的DF-1细胞系(DF-1-V)，研究NDV V蛋白拮抗干扰素的作用及其促进NDV在细胞增殖的作用。本研究主要内容和结果如下：1.表达NDV V蛋白转座子载体的构建以质粒载体pEGFP-N1-V(NDV La Sota V)为模板，利用PCR方法扩增NDV V基因并引入酶切位点（EcoR I和BamH I），以同尾酶相连的方式与双酶切（EcoR I和Bgl II）的PiggyBac转座子系统克隆质粒pTKL1-CMV-Puro-eGFP相连接，经酶切鉴定、测序分析后正确，将构建成功的重组质粒命名为：pTKL1-CMV-Puro-eGFP-V。2.稳定表达NDV V蛋白DF-1细胞系的建立采用LipofectamineTM2000将重组质粒pTKL1-CMV-Puro-eGFP-V和辅助质粒mPB共转染DF-1细胞，通过GFP观察，保持嘌呤霉素12μg/mL培养72h筛选，Western blot检测V蛋白表达，获得表达NDV V蛋白单克隆细胞，取10代、30代和60代克隆细胞GFP观察和Western blot检测V蛋白可稳定表达，获得稳定表达NDV V蛋白的DF-1细胞系，命名为：DF-1-V。结果说明PiggyBac转座子可应用于稳定表达外源基因禽源稳定细胞系的建立。3. V蛋白的表达对DF-1-V细胞干扰素β水平的影响培养DF-1和DF-1-V细胞24h，用ConA刺激细胞，同时设立空白对照，24h后采用Real-time RT-PCR检测IFN-β在mRNA水平的表达量，结果显示：细胞DF-1和DF-1-V之间IFN-β相对表达量差异不显著（P﹥0.05）；DF-1-V经刺激源ConA刺激之后，和DF-1细胞相比较干扰素β相对表达量差异极显著；细胞DF-1-V经ConA刺激之后，和DF-1-V相比较差异显著（P﹤0.05）。结果说明V蛋白的表达对IFN-β的产生有明显地抑制作用。4.NDV La Sota株在DF-1-V稳定表达细胞系的增殖培养细胞DF-1和DF-1-V，待生长约90%单层时，接种NDV La Sota株，同时设立阴性对照，每隔12h观察细胞细胞病变，并收获病毒。24h后DF-1和DF-1-V细胞出现病变，但DF-1-V细胞出现病变比DF-1细胞大约早8h。采用Real-time RT-PCR方法检测病毒增殖效果。结果显示NDV La Sota株在DF-1和DF-1-V细胞增殖48h时差异较大，DF-1细胞增殖病毒拷贝数是102.5，DF-1-V细胞的病毒拷贝数是105.2；72h时病毒滴度最高，DF-1细胞的病毒拷贝数是106.1，DF-1-V细胞病毒拷贝数为106.4。结果表明DF-1-V细胞系中V蛋白的稳定表达抑制了IFN-β的生成，促进NDV La Sota株在DF-1细胞内增殖。