基于Ferritin的自固定化及寡聚化酶的理性构建及催化性能

来源 :华侨大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiapehe
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酶分离纯化、固定化及提升催化性能一直是生物催化领域的研究热点和前沿,也是众多研究者致力解决的难点。研究和开发新型的纯化、固定化及提升催化性能的方法,降低对纯化设备的要求,提高储存性能及降低生产成本,对工业应用具有重要意义。铁蛋白(Ferritin)具有自组装成二十四聚体的特点,其主要用于生物矿化模板和药物输送等,而寡聚化是提高酶学性质的有效手段之一,通过基因工程技术将铁蛋白与目标酶融合,达到提升酶性能及极大简化酶制备过程之目的。为此,本论文主要开展以下工作:首先,将木聚糖酶经类弹性蛋白多肽(ELPs)与Ferritin融合,以便利用可逆热循环(Inverse thermal cycling,ITC)纯化目标酶,出人意料的是,该融合蛋白形成了微米级蛋白质颗粒,可通过低速离心的方式纯化,更加省时简便。有趣的是经低速离心所得融合蛋白沉淀具有酶活力,故可视为无载体固定化酶,将其重复利用10次后仍有60.0%左右的初始酶活力。更有趣的是,将其于缓冲液中静置在室温下一段时间后,随着时间的延长,上清逐渐出现酶活,其比活力最高可达265.74 U/mg,且可溶性酶聚集体热稳定性提高明显,如:50℃下孵育10 min时游离酶只剩17.7%的酶活力,而可溶性酶聚集体仍具有103.6%的酶活力。因此,Ferritin与木聚糖酶融合后,使得目标酶在分离纯化、重复使用及稳定性等方面有较大改善。但是,可能由于ELPs的存在,导致所得酶(可溶状态或者不可溶状态)酶活力及催化效率较游离酶下降较明显,分别为30.06 IU/ml、10.26 ml/mg/s(可溶状态)和23.18 IU/ml、0.19 ml/mg/s(不可溶状态),而游离酶则为162.67IU/ml、27.55 ml/mg/s。其次,针对ELPs降低了酶比活力及催化效率的问题,改进了融合基因构建方式,将ELPs切除,再次验证其纯化方式及酶学性质。结果表明,切除ELPs之后的融合蛋白依然可通过低速离心(离心力仅为2500×g)实现纯化,其酶活回收率为60.1%,所得不溶性活性木聚糖酶在重复使用20次后仍具有88.0%的初始酶活。同时,将其于缓冲液置于30℃下20天后,酶活力是起始酶活的1.7倍。更重要的是,自发复溶形成的可溶性木聚糖酶聚集体其比活力最高可达1175.77 U/mg,而游离酶只有110.69 U/mg,仅为前者的1/10。同时,50℃下半衰期约为2727.07 min,为游离酶的482.67倍,显著提高了目标酶热稳定性,催化效率也较游离木聚糖酶提高了106.9%。之后,探讨了该不溶木聚糖酶活性聚集体形成的机理可能是由于Ferritin亚基和木聚糖酶之间的疏水相互作用所致。据此,建立了一种分离纯化木聚糖酶及提升木聚糖酶催化性能的新方法,该方法具有条件温和,操作简单,提升酶学性能显著的优点。最后,为了进一步验证该方法的通用性,选择了一个不同于木聚糖酶的地衣多糖酶(该酶等电点不同于木聚糖酶,为酸性),通过Ferritin标签融合地衣多糖酶。所得结果与木聚糖酶相似。同样,目标酶也可以经低速离心得到,所得不溶活性地衣多糖酶亦可用作无载体自固定化酶,重复使用10次以后,仍保持初始酶活力的50.0%。同时自发回溶所得可溶性活性地衣多糖酶聚集体的比活力是游离地衣多糖酶的12.09倍,45℃下其半衰期是游离地衣多糖酶的2688.20倍,而催化效率是游离地衣多糖酶的7.11倍,各种催化性能指标均显著提高,从而证实了该方法具有一定的普适性。上述结果表明,Ferritin有望成为一个新型分离纯化及无载体自固定化酶的标签,同时也可作为自发回溶目标酶聚集体提升催化性能的标签。有望推动酶从实验室研究迈向工业应用,具有重要的理论和应用价值。
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