随着植物基因工程的发展，将多个基因转化植株已成为研究的热点之一，利用连接肽进行多个基因融合的策略已引起广泛关注。以2A和LP4为连接肽表达的融合基因在植物中表达时会发生剪切，将两个基因分开。本论文利用连接多肽2A和LP4/2A分别与抗虫新基因Bt crylAh和编码EPSP合酶的耐草甘膦基因mG<,2>连接起来构建融合基因表达载体，既可以达到两个基因的融合，又可以通过剪切形成两个蛋白分别行使功能。 为了比较连接肽2A和LP4/2A的剪切效率，以及不同基因与连接肽连接位置差异对基因表达的影响，利用重叠PCR及DNA克隆技术共构建了四个融合基因表达载体：pHAG、pHLAG、pGAH、pGLAH。其中pHAG、pill,AG为crylAh基因在前，mG<,2>基因在后，前者以2A为连接肽，后者以LP4/2A为连接肽；pGAH、pGlJAH为mG<,2>基因在前，crylAh基因在后，前者以2A为连接肽，后者以LP4/2A为连接肽。同时构建了两个单基因载体pSAh、pSmG<,2>作为对照，比较两基因在不同载体中表达量的异同。 利用农杆菌介导法将构建的植物表达载体转入烟草中，得到再生植株529株，经GUS组织化学分析，其中有261株再生苗为阳性植株，转化率达到49.3％；对GUS检测结果阳性的植株，分别利用crylAh，mG<,2>基因内部引物进行PCR扩增，结果表明目的基因整合到了烟草的基因组中；RT-PCR结果显示转化的外源融合基因在烟草体内正确转录，融合基因在转录水平上没有发生剪切；Western Blot结果表明crylAh基因和mG<,2>基因在植物体内正确翻译并且完全剪切；ELISA检测转融合基因表达载体pGLAH烟草中mG<,2>蛋白的表达量达到转基因烟草叶片可溶性总蛋白的0.33％，明显高于对照载体及其它融合基因表达载体，而crylAh在各载体中的表达量都在0.2％以上。 将获得的转基因烟草进行了生物活性测定。抗虫性生测为棉铃虫初孵幼虫，结果表明转融合基因表达载体植株对棉铃虫的校正死亡率均在90％以上；草甘膦耐受性检测选用浓度为3‰的草甘膦喷洒T<,0>代植株叶片，融合基因表达载体pGLAH表现出良好的抗性，存活率为100％，还对T<,1>代转基因烟草种子在含有草甘膦培养基上的出芽及生长情况进行了统计，结果表明转融合基因表达载体的转基因植株具有草甘膦耐受性，其中转融合基因表达载体pGLAH的烟草种子可以在5mM的草甘膦培养基中正常发芽、生长，高耐植株占检测植株的87.5％。相对于单价基因表达载体，融合基因表达载体表现出较高的抗虫性和耐草甘膦性。 以上转基因烟草的分子生物学分析以及生物活性分析均证明：以LP4/2A为连接肽时，两个基因的表达水平高于单独表达的基因，同时在连接肽前面基因的表达要高于其在连接肽后面基因的表达。