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检测HBV感染后慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化及肝癌患者外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类分子表达，建立检测相应患者淋巴细胞内HLA-A mRNA方法；应用人IL-2刺激患者淋巴细胞并进行LDH释放试验；探讨慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血淋巴细胞HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ类抗原分子在宿主细胞免疫状态中的作用，对患者细胞免疫功能紊乱机制提供新的思路。
方法：
1、流式细胞术检测外周血淋巴细胞表面HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子：
淋巴细胞抗体的标记：取四支试管，标记为HLA-Ⅰ-Ctr、HLA-Ⅱ-Ctr、HL-A-I、HLA-Ⅱ；取同型对照液IgGl-FITC 10u1分别加入HLA-Ⅰ-Ctr、HLA-Ⅱ-Ctr管中，分别取10ulHLA-ABC-FITC、HLA-Ⅱ-FITC-加入HLA-I、HLA-Ⅱ管中；各管中加入100ul抗凝全血。以标准微球调整仪器，以HLA-Ctr管做阴性对照。在前散射和测散射Dotplot二维图中，划出淋巴细胞区，收集10<4>个细胞，然后对淋巴细胞作FITC荧光强度检测，荧光强度以对数放大，光反射数据存软盘，全部数据用CellQuest Plot软件进行单色荧光参数获取及分析。
2、RT-PCR检测外周血淋巴细胞HLA-A mRNA含量：根据GenBank中公布的HLA-A基因序列，选取基因非多态区域外显子4，5的部分碱基，设计表达HLA-A基因位点的上下游引物，分别标记为p1，p2，外周血淋巴细胞(PBL)的提取；提取的RNA与不同的引物组合置于RT-PCR．反应体系中扩增，以539bp的β-actin作为内参照，扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，筛选与预期片段相吻合的特异性引物。将上述PCR扩增产物进行电泳，以1.5％琼脂糖凝胶，电压120v，然后于凝胶成像分析系统上扫描，电泳结果通过Bandscan软件分析，计算相对灰度值。
3、LAK细胞杀伤活性测定
无菌制备人外周血淋巴细胞；将收取的淋巴细胞用完全培养液稀释至浓度为1×10<8>个/L。在37℃，5％CO<,2>培养箱中培养五天，于第二、四天添加完全培养液，观察细胞生长情况。按CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒操作指南选择最佳靶细胞数0.5×10<,8>/ml。用CM调整效应细胞一淋巴细胞的浓度，以效应细胞和靶细胞按20：l比例混合加入96孔板，每个试验设四个副孔，同时设效应细胞和靶细胞自发释放孔，靶细胞最大释放孔，培养液对照孔，将细胞培养板移入CO<,2>恒温培养箱，在37℃，5％CO<,2>浓度和饱和湿度的条件下培养4h后，离心1000 rpm，4min，取上清50μl，用多孔加样板转移至96孔培养板中，在每个孔中加入50 μl substract buffer,避光室温30min后，每孔加入50μ1 stop solution,在酶联检测仪上，选择492nm检测波长，645nm参考波长，以培养液对照孔调零，测定各孔吸光度A，计算LAK细胞活性。
结果：
1、外周血淋巴细胞HLA-I类分子平均荧光强度在慢性乙型肝炎(335．80)、肝炎后肝硬化(309.78)、肝癌患者(114.04)与正常对照组(565.08)均有显著性差异(p<0.01)，随慢性乙肝、肝硬化、肝癌病情的加重外周血淋巴细胞HLA-I类抗原平均荧光强度逐步降低。外周血淋巴细胞HLA-I类分子表达率在慢性乙肝、肝硬化、肝癌患者分别为99.24[％]，97.84％、96.45％，与正常对照组(99.83％)无显著性差异(p>0.05)。
2、HLA-II类分子表达率在慢性乙型肝炎为(38.28％)、肝炎后肝硬化(42.21％)、肝癌患者(52.75％)，其中肝硬化组和肝癌组与正常对照组(32.50％)有显著性差异(p<0.01)；慢性乙型肝炎组和正常对照组无显著性差异(p>0.05)。外周血淋巴细胞HLA．II类分子平均荧光强度在慢性乙肝、肝硬化、肝癌患者分别为66.0、77.36、88.96，与正常对照组(60.39)无显著性差异(p>0.05)。
3、HLA-A mRNA在慢性乙型肝炎，肝硬化，肝癌患者中表达明显低于正常对照组(p<0.05)，而且随慢性乙型肝炎，肝硬化，肝癌患者病情逐步加重HLA-A mRNA的含量下降。
4、慢乙肝组、肝硬化组和肝癌组患者淋巴细胞体外经IL-2诱导对肝癌细胞的杀伤活性下降，随慢性乙肝、肝硬化、肝癌病情的加重外周血淋巴细胞体外诱导杀伤活性有逐步降低趋势。
结论：
1、在国内率先进行了慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者外周血淋巴细胞HLA-I、II类抗原分子的检测，为进一步研究淋巴细胞膜表面HLA-I类抗原分子的功能和作用奠定了基础。
2、成功建立了检测外周血淋巴细胞内HLA-A mRNA的RT-PCR一步法，并首次应用于慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、肝癌患者的研究，从基因转录水平上探讨机体细胞免疫状态与HLA-A的关系，随病程进展淋巴细胞内HLA-AmRNA下降更为显著，且有望成为反映细胞免疫状态的指标之一。
3、慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞HLA-I类分子表达降低，肝硬化和肝癌患者降低更为显著，淋巴细胞HLA-II类分子表达率逐渐增强，患者体内可能存在HLA-11分子限制的CD4<+>Th或B细胞活化增强。
4、外周血淋巴细胞体外诱导培养并检测杀伤活性反映了宿主的细胞免疫功能，乙肝病毒感染后随病情发展其淋巴细胞杀伤活性逐渐降低，并与淋巴细胞表面HLA-I类抗原的平均荧光强度及HLA-A Mrna含量的降低密切相关，以肝癌患者降低最为显著。