研究背景各种原因所致的气管损伤严重威胁患者的生命,气管移植重建的技术目前仍是临床医生面临的一个重大挑战。近年来,有关研究主要集中在应用组织工程技术、自体组织或同种异体组织等构建工程气管进行气管重建。但由于气管特殊的解剖结构和生理特点,气管移植后出现的血管重建不良、气管腔内持续暴露于外界环境所致的感染、气道上皮再生障碍、力学特性与自体气管不相匹配等问题,使得气管重建往往以失败告终。一个成功的气管移植以及长期稳定的气道功能恢复,目前仍旧难以实现。理想的组织工程气管首先应当具备与自体气管相匹配的力学强度,其次应当具备较高的组织相容性以便在移植后能够实现快速的血管化和气道上皮再生。因此寻找一种可行的方法来构建一种能够诱导机体新生血管生成和气道上皮再生的组织工程气管,对实现气管损伤后的功能重建具有重大的意义。应用支架、生物材料和种子细胞等要素的整合来构建组织工程气管已经成为当前重要的研究方向。脱细胞基质（ACM）作为生物材料的研究热点之一,在一定程度上保留了细胞外基质（ECM）的主要成分和结构,能够为体内创伤修复和组织再生提供细胞黏附和增殖的骨架空间和物质基础。应用ACM构建的气管移植体虽然表现出了较好的生物学相容性,但是仍存在术后气管狭窄发生率高的问题,而且气道上皮重建不完全,难以恢复气道的功能,导致气管移植失败。因此大量研究采用各种生物活性成分对组织工程材料进行修饰,优化材料的成分、微观结构和生物活性,提高组织工程气管诱导快速血管化和气道上皮再生的能力。最近研究表明ACM的微观网络结构中存在基质结合囊泡（MVs）,作为ECM与细胞之间传递生物学信号的载体,对巨噬细胞的极化、炎症反应和细胞的迁移增殖发挥调节作用,促进损伤组织修复再生。在组织工程气管的构建中,为了避免直接应用细胞导致的并发症,研究者尝试将干细胞的活性因子直接附载在材料上发挥作用。大量研究证实牙龈间充质干细胞（GMSCs）分泌的细胞外囊泡（EVs）在各类组织损伤的修复过程中发挥抗炎和免疫调节的积极作用。研究目的我们前期研究中应用快速降解弹性体聚癸二酸甘油酯（PGS）与聚己内酯环（PCL）构建了节段性组织工程气管,首次将快降解的生物材料作为制备工程气管的主体材料,在体内实现了快速的血管化、细胞募集和胶原沉积,但未能实现气道功能性上皮的再生。同时我们还证实了软骨细胞膜片的ACM可以促进关节软骨缺损后的修复再生,然而气管功能重建的复杂性要求我们必须对组织工程气管的构建做出更多的优化和调整,来满足气管再生的各方面需求,我们设想构建一种富含生物学活性的ACM组织工程气管,在保证力学强度的前提下,赋予其诱导血管新生和上皮再生的生物学效能,启动体内气管再生的关键环节,实现气管损伤后的功能重建。因此我们以PGS为载体,锚合富集h GMSCs-MVs的软骨细胞ACM（g MVs-c ACM）,构建气管补片,评估其在体外和体内的生物学活性,并探索其在体内气管移植后重建过程中的作用和相关机制。研究方法本研究由四部分实验组成。1.构建可外科缝合的cACM-PGS/PP气管补片首先将兔耳软骨细胞（CHs）接种于三种不同孔隙的PGS/聚丙烯（PP）复合支架的表面,在体外经2周动态培养形成软骨细胞细胞外基质（c ECM）,采用力学分析,扫描电镜（SEM）,透射电镜（TEM）,组织学染色和ECM成分定量的方法,根据不同孔径PGS表面形成c ECM的力学强度,微观结构以及ECM中不同成分的含量,筛选出最适合CHs增殖和c ECM分泌的PGS孔隙特征;再对c ECM进行三种不同方法的脱细胞处理,评估软骨细胞脱细胞基质（c ACM）的微观结构、组织学形态和基质成分含量,筛选出最优的脱细胞流程,构建可外科缝合的c ACM-PGS/PP气管补片。2.g MVs-c ACM-PGS/PP气管补片的构建及其体外生物学效应的研究分离培养h GMSCs,应用流式细胞分析和干细胞三向分化实验鉴定GMSCs;按不同比例将GMSCs与CHs共同接种于PGS/PP支架上进行体外动态培养2周,根据组织学染色和大体分析筛选出最适合的细胞共培养比例;应用实验一优化的脱细胞流程构建g MVs-c ACM-PGS/PP气管补片,采用力学分析、SEM、TEM、组织学染色、银染法和Western blot的方法,研究对比g MVs-c ACM-PGS/PP与c ACM-PGS/PP的蛋白成分差异和微观结构特点;采用粒径分析、TEM和Western blot确定了g MVs的大小、形态和标记蛋白;应用蛋白组学分析和ELISA对g MVs-c ACM-PGS/PP的活性成分进行了初步的检测;采用Transwell共培养、划痕实验、免疫荧光染色和Western blot对g MVs在体外进行示踪,并验证和评估g MVs-c ACM-PGS/PP在体外对人支气管上皮细胞（HBEs）迁移和增殖行为的影响。3.gMVs-cACM-PGS/PP气管补片在兔气管局灶性损伤模型中促进气道纤毛上皮再生的研究采用兔气管局灶性缺损的模型,评估gMVs-cACM-PGS/PP气管补片在体内气道损伤重建中的作用。在兔皮下包埋补片,通过组织学染色观察补片在体内1周和3周时全身和局部的毒性反应;应用小动物活体成像技术对经Di O标记的g MVs在体内的分布和释放情况进行示踪和评估;应用PGS/PP,c ACM-PGS/PP,g MVs-c ACMPGS/PP 3组补片进行兔气管局灶性缺损的移植修复,采用大体分析、Micro-CT、组织学染色、SEM和免疫荧光染色比较3组气管补片在兔气管重建过程中的作用,包括动物生存率、气道狭窄率、新生气道上皮的细胞分型及黏膜下血管化情况。4.gMVs-cACM-PGS/PP气管补片促进兔气管损伤功能重建的机制研究对cACM-PGS/PP和gMVs-cACM-PGS/PP 2组气管补片在体内气管重建的新生气道上皮组织进行蛋白组学分析;针对差异表达蛋白的富集分析、KEGG分析和GO分析的结果,应用免疫荧光染色和Western blot验证差异表达蛋白在2组新生上皮中的表达差异和黏膜下血管化水平的差异;通过Transwell共培养、划痕实验、免疫荧光染色和Western blot检测并评估g MVs通过释放TGF-β1与JAK2-STAT1信号通路交互作用影响HBEs细胞迁移和增殖行为的作用机制。研究结果1.通过对PGS材料特性的筛选和脱细胞流程的优化,确定了PGS的孔隙参数为30~38μm时更有利于CHs的黏附和增殖以及c ECM的分泌与沉积;同时确定了以1%SDS洗脱6 h可以达到对c ECM完全的脱细胞效果,并且对ECM成分的破坏和影响最小,成功地构建了一种可缝合的c ACM-PGS/PP气管补片。2.确定GMSCs表达CD29、CD44和CD105这3种MSCs的标志性蛋白,并能够实现向成骨、成脂肪和成软骨的三向分化特性;在实验一的研究基础上,将h GMSCs与CHs以1:4的比例进行体外共培养,可以构建g MVs-c ACM-PGS/PP气管补片;g MVs-c ACM与c ACM的蛋白成分有明显差异,且g MVs-c ACM中细胞外囊泡的标志性蛋白CD9、CD81和TSG101表达水平明显高于c ACM,且g MVs的大小形态都符合EVs的特征;蛋白组学结果提示g MVs-c ACM与c ACM之间的差异表达蛋白主要富集在细胞外结构域,并与细胞增殖和血管生成等信号通路相关;ELISA结果表明g MVs富含TGF-β1、VEGF和KGF 3种细胞因子;体外实验证实g MVs可以在体外缓慢释放并被HBEs摄取,促进HBEs迁移和增殖,同时显著提高HBEs内CD44、MMP9、Cyclin D1和AXIN2的表达水平。3.组织学结果证实g MVs-c ACM在兔体内未产生明显全身性和局部组织毒性反应;Di O标记的g MVs可以在动物体内释放并在一定时间内维持相当的浓度水平;在兔气管局灶性损伤模型中,g MVs-c ACM组动物移植后气道畅通且生存率显著提高,而c ACM组动物气道狭窄率和死亡率明显高于g MVs-c ACM组;组织学结果表明g MVs-c ACM可以显著提高气道黏膜下血管化水平并促进气道纤毛柱状上皮细胞快速再生,新生上皮细胞中高表达CK5+8,β-TubulinⅣ,而c ACM组结构紊乱的新生上皮中高表达杯状细胞的标记物Mucin5AC。4.依据体内蛋白组学分析和免疫荧光染色等方法,证实了gMVs-cACM组新生的气道上皮组织中p STAT1表达量显著增加,同时黏膜下组织的血管内皮标记蛋白CD31表达量也明显高于c ACM组;通过体外实验证实g MVs释放的TGF-β1可能作用于HBEs中JAK2-STAT1信号通路,促进了HBEs的迁移和增殖,揭示了g MVs-c ACM在气道损伤中实现气道上皮再生和功能重建可能的分子机制。研究结论本研究创新性地将高生物学活性的GMSCs-MVs通过人工构建的方式有机结合在c ACM的微观结构中,并以弹性多孔的可降解合成材料PGS为载体,成功地构建了g MVs-c ACM-PGS/PP气管补片,解决了ACM供体资源短缺的问题同时赋予其强大的诱导组织再生的潜能,证实其在体内和体外均有力地促进了气道上皮迁移和增殖,解决了长期以来气管损伤重建中功能性气道上皮再生障碍的瓶颈问题,为节段性组织工程气管的构建提供了新的方法和策略;同时还初步阐明了g MVs促进气道上皮再生的相关分子机制,为其临床转化提供了一定的理论依据。g MVs-c ACM气管补片作为一种无细胞移植且具有超高生物学活性的组织工程气管替代物,可以满足临床中个性化定制的需求,具有较高的临床转化和应用的价值。