【研究背景】牙周炎是发生在牙周支持组织的慢性感染性疾病,发病率极高。牙周炎治疗和牙周缺损组织的再生修复是国际关注的难题。近20年来,干细胞和再生医学研究取得重要进展,利用再生医学的原理促进牙周组织结构再生日益成为一个崭新的研究领域。牙周炎是一种炎症环境下,成骨和破骨水平失衡导致的组织破坏性疾病,因此通过生物材料设计和信号分子控释的方法,重塑一个有利于干细胞生存的微环境,同时调控体内干细胞成骨和抑制破骨细胞破骨,是实现牙周组织再生的关键问题。而常用生物材料设计策略中使用的生长因子因在体内半衰期短、活性不稳定等缺陷,在体内应用受到极大限制。近两年兴起的微量元素除了具有促进干细胞再生潜能和促进成骨的作用之外,还具备生物特征稳定、可随生物陶瓷材料缓慢降解持续发挥调控组织再生作用的优势,成为取代生长因子的绝佳替代品。钼（Molybdenum,Mo）是几乎所有生物体的必需微量元素,已被确定为参与各种氧化还原反应和氧原子转移的50多种酶的活性位点的一部分。钼缺乏会导致严重的先天性代谢错误,经常导致儿童早期死亡。尽管高剂量的Mo离子可能会损害线粒体功能,但研究发现,将适量浓度的Mo离子掺入生物玻璃陶瓷支架中可有效刺激体外细胞增殖和分化,具有促进成骨和成软骨的作用。此外,还有报道含有Mo元素的酶（例如,亚硫酸盐氧化酶）直接参与调控线粒体功能,而线粒体功能与巨噬细胞的表型和功能密切相关。因此,我们提出科学假说,将Mo离子掺入具有促进组织再生功能的生物玻璃陶瓷材料（Mo-doped bioactive glass ceramic,Mo-BGC）中,从大型犬牙周缺损模型体内实验和体外细胞生物学实验两个层面,证实Mo-BGC支架材料可以促进干细胞成骨分化潜能、抑制破骨细胞活性,同时通过调节巨噬细胞线粒体功能改变巨噬细胞表型,为复杂牙周组织再生构建一个有利于组织再生的微环境,进而发挥促进组织再生的效果。【研究目的】成功制备三维（3 Dimensional,3D）打印BGC/Mo-BGC材料并对其理化性能进行表征,明确BGC/Mo-BGC材料在犬牙周缺损模型中对组织再生的促进作用、对成骨-破骨活性和巨噬细胞极化状态的调节能力;探讨BGC/Mo-BGC浸提液对干细胞成骨分化潜能和破骨细胞活性的调控作用;探讨BGC/Mo-BGC浸提液对巨噬细胞极化状态的调控作用,探索Mo离子通过调控线粒体功能改变巨噬细胞极化状态的深层机制。【研究方法】1.BGC/Mo-BGC支架制备、表征和细胞相容性检测:首先,溶胶-凝胶法制备3D打印的BGC/Mo-BGC材料,对材料进行表征。光学相机记录材料大体形貌,扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）记录材料表面微观形貌,能量色散光谱仪分析材料中的离子分布,显微CT（Micro computed tomography,Micro-CT）记录材料的立体结构,电感耦合等离子体质谱仪（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）分析材料的降解行为。提取并培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDMs）,将细胞接种至材料表面,检测材料细胞相容性,SEM观察材料表面细胞的黏附和形态,活死细胞染色观察细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。BGC/Mo-BGC支架促犬牙周组织再生效果评价:构建犬牙周缺损模型,将BGC/Mo-BGC材料植入缺损区,日常观察和X线片检测材料在缺损区域的存留和伤口愈合情况,分别在材料植入后1周和8周处死动物,Micro-CT、亚甲蓝酸性品红染色和苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE染色）分析牙周缺损区域内新骨形成情况。BGC/Mo-BGC支架对体内成骨-破骨活动、巨噬细胞极化状态调控的动态影响:材料植入后1周、2周和4周,碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色观察缺损成骨-破骨活动的动态变化。植入材料后3天和7天,免疫荧光染色观察缺损区巨噬细胞的极化状态的动态变化。2.BGC/Mo-BGC浸提液对BMMSC成骨分化的影响:首先,制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的BGC/Mo-BGC浸提液为细胞培养基,分析BGC/Mo-BGC浸提液对小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs）成骨分化潜能的影响。细胞计数检测盒-8（Cell counting kit-8,CCK8）检测BMMSCs在不同培养基中的增殖能力,茜素红染色和ALP染色检测BMMSCs的成骨分化潜能。进一步,分析不同稀释比例BGC/Mo-BGC浸提液中钙（Calcium,Ca）、磷（Phosphorus,P）、硅（Silicon,Si）和Mo离子的浓度,配制含Mo离子的培养基,分析Mo离子对BMMSCs成骨分化潜能的影响。茜素红染色、ALP染色、成骨相关蛋白（Runx2和BSP-1）的表达（Western Blot）和成骨相关基因（SP7、Runx2和ALP）的表达（q RT-PCR）分析Mo离子对BMMSCs成骨分化潜能的影响。BGC/Mo-BGC浸提液对BMDM破骨分化的影响:首先,制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的BGC/Mo-BGC浸提液为细胞培养基,分析BGC/Mo-BGC浸提液对BMDMs破骨分化的影响。TRAP染色、免疫荧光和q RT-PCR检测BMDMs在不同培养基中的破骨分化能力、破骨相关蛋白（MMP9和肌动蛋白环）和基因表达情况（MMP9、NFATc1和RANKL）。进一步,配制含Mo离子的培养基,分析Mo离子对BMDMs破骨分化的影响。TRAP染色、免疫荧光和q RT-PCR检测BMDMs在含Mo离子培养基中的破骨分化能力、破骨相关蛋白（MMP9和肌动蛋白环）和基因表达情况（MMP9、NFATc1和RANKL）。3.BGC/Mo-BGC浸提液对巨噬细胞极化状态的影响:制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的BGC/Mo-BGC浸提液为细胞培养基,培养M0型巨噬细胞,观察BGC/Mo-BGC浸提液对M0型巨噬细胞极化的作用。通过免疫荧光染色检测M2极化相关蛋白（Arg/CD68和CD206/CD68）和M1极化相关蛋白（CCR7/CD68和i NOS/CD68）,q RT-PCR分析M2极化相关基因（Arg、CD206和IL-10）和M1极化相关基因（CCR7、IL-1β和TNF-α）的表达水平。再次,制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的BGC/Mo-BGC浸提液为细胞培养基,将M0型巨噬细胞诱导为M1型巨噬细胞,观察BGC/Mo-BGC浸提液调控M1型巨噬细胞极化的作用。免疫荧光染色检测M2极化相关蛋白（Arg/CD68和CD206/CD68）和M1极化相关蛋白（CCR7/CD68和i NOS/CD68）,q RT-PCR分析M2极化相关基因（Arg、CD206和IL-10）和M1极化相关（CCR7、IL-1β和TNF-α）的表达水平。最后,配制含Mo离子的培养基,培养M0型巨噬细胞,观察Mo离子对M0型巨噬细胞极化的影响。免疫荧光染色检测M2极化相关蛋白（Arg/CD68和CD206/CD68）和M1极化相关蛋白（CCR7/CD68和i NOS/CD68）,q RT-PCR分析M2极化相关基因（Arg、CD206和IL-10）和M1极化相关基因（CCR7、IL-1β和TNF-α）的表达水平。Mo-BGC浸提液中钼离子对巨噬细胞线粒体的靶向作用:将小鼠巨噬细胞在Mo-BGC浸提液中孵育,分析浸提液对巨噬细胞线粒体的影响。通过ICP-MS测定巨噬细胞线粒体中Mo、Si、Ca和P的质量。Mo-BGC浸提液中钼离子对巨噬细胞线粒体功能的影响:透射电子显微镜观察线粒体的纳米结构,线粒体膜电位探针（JC-1）测定巨噬细胞的线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）值,腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）测定试剂盒测定巨噬细胞中细胞内ATP的产生,流式细胞仪检测巨噬细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平。Mo-BGC浸提液中钼离子对巨噬细胞线粒体代谢的影响:将小鼠巨噬细胞在Mo-BGC浸提液中孵育,分析浸提液对巨噬细胞线粒体代谢的影响。对巨噬细胞进行代谢物定量和代谢组学分析,通过线粒体的耗氧率（Oxygen consumption rate,OCR）和细胞外酸化率（Extracellular acidification rate,ECAR）方法检测细胞线粒体代谢情况,Western Blot测定巨噬细胞中线粒体的呼吸链复合体的表达水平。进一步,使用含Mo离子培养基培养巨噬细胞,通过OCR和ECAR方法检测Mo离子对巨噬细胞线粒体代谢的影响;最后,抑制巨噬细胞线粒体功能,观察Mo-BGC浸提液对巨噬细胞极化的相应影响。免疫荧光染色观察巨噬细胞表达M2极化相关蛋白（Arg/CD68和CD206/CD68）和M1极化相关蛋白（CCR7/CD68和i NOS/CD68）表达情况,q RT-PCR检测巨噬细胞表达M2极化相关基因（Arg、CD206和IL-10）和M1极化相关基因（CCR7、IL-1β和TNF-α）的水平。【研究结果】1.Mo-BGC支架制备成功并具有良好细胞相容性:首先,光学相机、扫描电镜、能量色散光谱仪和Micro-CT观察显示,Mo-BGC支架材料性状均一、具有仿牙槽骨形态,且Mo离子被均匀的掺杂在Mo-BGC材料中。Mo-BGC支架材料释放的Mo离子浓度显著高于BGC支架释放的浓度,Mo-BGC支架材料的重量损失量显著低于BGC支架材料的质量损失量。Mo-BGC支架材料上的BMDMs细胞形态、细胞活力和细胞凋亡率与对照组无差异。Mo-BGC支架具有促犬牙周组织再生的效果:成功构建犬牙周缺损模型,在Mo-BGC支架材料植入后8周,牙周缺损区域的Micro CT扫描、亚甲基蓝酸性品红染色和HE染色及定量分析结果显示在牙根和支架材料周围可以观察到相对大量新形成的骨和新生血管。Mo-BGC支架在体内可促进成骨、抑制破骨,并调控巨噬细胞向M2型状态极化:将Mo-BGC支架材料植入牙周缺损模型中,术后2周和4周,由Mo-BGC支架材料移植物调控产生的ALP阳性细胞数量明显多于BGC支架材料产生的细胞数量;TRAP染色和阳性破骨细胞的定量分析表明,在术后2或4周,接受Mo-BGC移植组,其材料-组织界面边缘的破骨细胞数量远少于BGC移植组。此外,术后3天,免疫荧光显示两组之间的巨噬细胞类型无差异;术后7天,Mo-BGC组切片中的CD206+/CD68+细胞（M2巨噬细胞）多于BGC组。2.在体外,Mo-BGC浸提液具有促进干细胞成骨分化的潜能:制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的Mo-BGC浸提液为细胞培养基培养BMMSCs,CCK8检测发现Mo-BGC浸提液中孵育的细胞的增殖能力显著高于BGC浸提液中孵育的细胞;茜素红染色和ALP结果显示,与具有相同稀释比例的BGC浸提液相比,Mo-BGC浸提液使BMMSCs形成更多的矿化结节和更高的ALP活性。进一步,分析不同稀释比例Mo-BGC浸提液中Ca、P、Si和Mo离子的浓度,发现当稀释比小于1/32时,BGC和Mo-BGC浸提液中的Ca和P离子浓度没有显著差异,因此,后续选择1/32浓度的Mo-BGC浸提液用于下步研究以排除Ca和P离子对细胞的生物学影响。配制含Mo离子的培养基,分析Mo离子对BMMSCs成骨分化潜能的影响,茜素红染色和ALP染色结果发现外源性添加Mo离子组中成骨矿化结节形成能力和ALP活性较阴性对照组增强,与阳性对照组成骨能力接近。外源性添加Mo离子组和BGC浸提液中外源性添加Mo离子组均显著促进了成骨相关蛋白（Runx2和BSP-1）和基因（SP7、Runx2和ALP）的表达水平。在体外,Mo-BGC浸提液具有抑制破骨细胞活性的能力:制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的Mo-BGC浸提液为细胞培养基,TRAP染色结果显示BGC或Mo-BGC浸提液中破骨细胞的数量以剂量依赖性方式增加,相同稀释比例的Mo-BGC浸提液对破骨细胞形成具有比BGC浸提液更显著的抑制作用。免疫荧光染色结果显示Mo-BGC组的F-肌动蛋白环更小、破骨细胞生成相关蛋白（MMP9和NFATc1）强度更低。q RT-PCR测定结果显示Mo-BGC浸提液显著降低了破骨细胞生成相关基因（MMP9、NFATc1和RANKL）的表达。进一步,配制含Mo离子的培养基,分析Mo离子对BMDMs破骨分化的影响,结果发现,含Mo离子培养基对破骨细胞分化的抑制能力与Mo-BGC组一致。3.Mo-BGC浸提液具有调控M0和M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的作用:制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的Mo-BGC浸提液为细胞培养基,培养M0型巨噬细胞,观察Mo-BGC浸提液对M0型巨噬细胞极化的影响。免疫荧光结果显示,Mo-BGC浸提液中孵育的M0型巨噬细胞中有更多细胞高度表达M2极化标志物（Arg和CD206）。q RT-PCR分析显示,M0型巨噬细胞在Mo-BGC浸提液中孵育后,显著增加了M2极化相关基因（Arg和CD206）的表达水平。再次,制备稀释比例为1/4、1/32或1/128的Mo-BGC浸提液为细胞培养基,将M0型巨噬细胞诱导为M1型巨噬细胞,观察Mo-BGC浸提液对M1型巨噬细胞极化的影响。免疫荧光染色和定量分析显示,与对照细胞相比,在Mo-BGC浸提液中孵育的LPS预处理细胞中的M2巨噬细胞更多、M1型巨噬细胞更少;q RT-PCR分析结果显示在Mo-BGC浸提液中孵育的细胞表现出较高的M2极化相关基因（Arg、CD206和IL-10）的表达水平。最后,配制含Mo离子的培养基,培养M0型巨噬细胞,观察Mo离子对M0型巨噬细胞极化的影响。结果发现,含Mo离子的培养基与Mo-BGC浸提液效果一致,同样促进M0型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。Mo离子可靶向募集至巨噬细胞线粒体:将小鼠巨噬细胞在Mo-BGC浸提液中孵育,分析浸提液对巨噬细胞线粒体的影响。ICP-MS测定结果发现巨噬细胞在Mo-BGC浸提液中孵育后,线粒体中Mo的质量显著增加。Mo-BGC浸提液中Mo离子直接参与增强巨噬细胞线粒体功能的作用:透射电镜观察发现在BGC浸提液中孵育的细胞中线粒体肿胀的比例显著高于在Mo-BGC浸提液中孵育的细胞。JC-1染色显示与BGC相比,Mo-BGC组细胞中红色荧光强度与绿色荧光强度的比值显著增加。Mo-BGC浸提液培养的细胞的ATP产量最高。流式细胞术显示Mo-BGC浸提液显著降低了细胞内和线粒体内ROS水平。Mo-BGC浸提液可增强巨噬细胞氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation,OXPHOS）和三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle,TCA）,同时减弱糖酵解:将小鼠巨噬细胞在Mo-BGC的浸提液中孵育,分析浸提液对巨噬细胞线粒体代谢的影响。OCR和ECAR结果分析表明Mo-BGC浸提液可增强巨噬细胞TCA代谢产物和OXPHOS（与M2极化相关）,同时减少巨噬细胞的糖酵解代谢产物（与M1极化相关）。Western Blot结果显示Mo-BGC组的细胞比BGC组和对照组的细胞中复合物I亚基、复合物II亚基和复合物V亚基表达水平更高。进一步,使用含Mo离子培养基培养巨噬细胞,通过OCR和ECAR方法检测Mo离子对巨噬细胞线粒体代谢的影响,结果发现Mo离子组与Mo-BGC组水平一致。最后,抑制巨噬细胞的线粒体功能,观察Mo-BGC浸提液对巨噬细胞极化的相应影响。免疫荧光显示抑制巨噬细胞线粒体功能,显著降低了Arg+/CD68+和CD206+/CD68+细胞（M2巨噬细胞）的数量,同时增加了M1极化相关标志物的比例（i NOS和CCR7）。q RT-PCR进一步表明,所有抑制剂均显著降低了M2极化相关基因（Arg、CD206和IL-10）,并增加M1极化相关基因（CCR7和IL-1β）。【研究结论】1.本研究成功制备了类牙槽骨形态的3D打印BGC/Mo-BGC支架材料,该材料具有良好的细胞相容性,在犬牙周缺损模型中,Mo-BGC支架材料具有促进新骨和血管形成的组织再生调控能力。2.Mo-BGC材料在体内具有促进干细胞成骨、抑制破骨细胞生成的能力,同时具有促进巨噬细胞向M2型状态极化的能力。3.在体外,Mo-BGC浸提液具有促进干细胞成骨分化潜能和抑制破骨细胞活性的能力,还具有促进M0和M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化的能力。Mo-BGC支架材料对干细胞成骨分化、破骨细胞生成抑制和巨噬细胞极化的调控是Mo离子发挥的作用。4.Mo-BGC材料中的Mo离子通过调控巨噬细胞从细胞糖酵解代谢向线粒体TCA和OXPHOS代谢途径转变,调控巨噬细胞向M2型状态极化。