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目的:已有文献报道c AMP依赖性蛋白激酶(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和Src家族激酶(Src family kinases,SFKs)在调节神经元可塑性中起着重要作用。本实验主要在正常大鼠离体培养的下丘脑弓状核(hypothalamic arcuate nucleus,ARC)神经元上研究PKA、PKC、SFKs对神经细胞兴奋性的调节作用和三种激酶之间的相互调控关系,并探讨其机制,为课题组深入研究蛋白激酶介导ARC参与中枢敏感化机制提供实验依据。方法:1.原代培养新生1天Sprague-Dawley(SD)大鼠的ARC神经元;2.全细胞膜片钳技术记录神经元放电,并观察PKA、PKC和SFKs对ARC神经元兴奋性的影响;3.Western blot技术检测ARC细胞中p PKA、p PKC和p SFKs表达水平;4.免疫细胞化学技术和Western blot技术检测PKCα和PKCβⅡ的转位情况。结果:1.全细胞膜片钳(电流钳)记录显示:(1)在PKA激动剂forskolin(FSK)(1μM、10μM、50μM和100μM)+50μM IBMX(磷酸二酯酶抑制剂)作用下,ARC神经元放电频率呈剂量依赖性增加,其中50μM和100μM浓度组与对照组相比,有显著性差异(P<0.01,P<0.001);PKA抑制剂KT5720能够阻断FSK+IBMX的兴奋作用。(2)在PKC激动剂PMA(0.1μM、1μM、5μM和10μM)的作用下,ARC神经元放电频率也呈剂量依赖性增加,其中1μM、5μM和10μM浓度组与对照组相比,均有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.05);PKC抑制剂GF109203x或Chelerythrine chloride(CC)均可阻断PMA的作用。(3)SFKs激动剂EPQ(p Y)EEIPIA可上调ARC神经元兴奋性,并呈现一定时间效应关系,表现为作用3 min后即开始出现ARC神经元放电频率增加,10 min和15 min时作用显著(P<0.01),分别达到给药前的1.45±0.11倍和1.49±0.15倍;应用SFKs抑制剂PP2能够阻断EPQ(p Y)EEIPIA引起的神经元兴奋性增加。(4)SFKs抑制剂PP2能够阻断PKA或PKC激动剂所引起的ARC神经元兴奋性增加,与无活性的PP3相比,差异显著(P<0.05,P<0.01)。(5)PKC抑制剂GF109203x能够阻断SFKs激动剂EPQ(p Y)EEIPIA所引起的ARC神经元兴奋性增加,而PKA抑制剂KT5720则不能。2.Western blot结果显示:(1)在PKA激动剂FSK+IBMX作用下,ARC细胞中p PKA表达显著增加,与Naive组相比,具有统计学意义(P<0.01),同时Y416位点的p SFKs表达也增加(P<0.01),但p PKC(pan)和p PKCα/βⅡ表达无明显变化;KT5720能够抑制PKA激动剂所引起的p PKA和p SFKs的表达增加。(2)在PKC激动剂PMA作用下,p PKC(pan)、p PKCα/βⅡ和p SFKs(Y416)表达显著增加,与Naive组相比,具有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.01),而p PKA表达无明显变化;PKC抑制剂GF109203x或CC均可抑制PMA所引起的p PKC(pan)、p PKCα/βⅡ和p SFKs表达增加。(3)PP2预处理后能够抑制PKA激活所引起的p SFKs表达增加,而p PKA表达则不受影响,依然显著增加(P<0.05);PP2也能够抑制PKC激活所引起的p SFKs表达增加,而不影响p PKC(pan)和p PKCα/βⅡ的表达增加(P<0.01,P<0.05)。3.免疫细胞化学和Western blot结果提示:PKC激动剂PMA能够引起PKCα和PKCβⅡ从胞浆转位到胞膜,PKC抑制剂CC可阻断PMA的作用,而另一个PKC抑制剂GF109203x或SFKs抑制剂PP2则不能阻断PMA所诱导的PKC转位。结论:1.PKA、PKC、SFKs能够调节ARC神经元兴奋性,表现为ARC神经元放电频率增加。2.PKA可能是激活SFKs的上游调控因子,因为SFKs抑制剂可以阻断PKA对ARC神经元的调节作用及p SFKs表达的增加,p PKA表达增加不受抑制;而PKA抑制剂则不能阻断SFKs对ARC神经元的调节作用。3.PKC和SFKs在对ARC细胞活动的调节中可能存在交互作用关系,因为抑制SFKs可消除PKC激活所引起的ARC神经元兴奋性上调及p SFKs表达的增加,而p PKCs表达增加不受抑制;同时,抑制PKC也可阻断SFKs激活对ARC神经元兴奋性的上调。4.PKC调节ARC神经元兴奋性可能并不是通过PKCα和PKCβⅡ转位引起的。