抗肿瘤药物通过化学键合或物理包封的方式负载于聚合物载体上构建的聚合物释药体系，能够改善小分子药物体内代谢速度快、半衰期短、水溶性差等缺陷，提高药物的生物利用度，是改善化疗效果的重要手段之一。通过化学键或连接臂将药物连接到大分子上形成的聚合物-药物接枝物和两亲性聚合物包载药物形成的聚合物胶束是其中两种重要方式。
　　良好的聚合物载体是实现多功能药物递送的平台和基础。常用的载体材料有多糖类、聚氨基酸类和聚酯类等，其中聚酯类是给药系统中应用最为广泛的一种，如聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚甲基丙烯酸羟基丙基酯(PHPMA)等。但它们普遍存在水溶性差、降解缓慢、可修饰基团有限等不足。聚苹果酸(PMLA)是以苹果酸为单体，之间通过酯键连接的脂肪族聚酯，其在生理条件下相对高溶解性、高自发降解效率和无免疫原性等使其成为优于多糖、聚酯的新型药物控释载体材料。不同形式的PMLA药物已有零星报道，但是，尚缺乏对其用作载体的系统性研究。
　　合适的载体能够实现药物的高效递送，但要发挥抗肿瘤作用，还需要药物在特定的组织或细胞中游离。相比于正常组织，肿瘤部位具有特异性的pH(肿瘤pH低于正常组织)、酶(某些酶在肿瘤部位特异性高表达)、还原性等微环境，为设计药物的肿瘤特异性响应释放提供了条件。
　　聚合物释药体系除能依赖被动靶向作用在肿瘤部位富集，还可以修饰抗体、靶向分子等，实现肿瘤主动靶向。但是，肿瘤细胞群具有杂多性，细胞表面有不同受体或抗原表达，通常为特定抗原或受体设计的主动靶向方法对于杀伤肿瘤细胞并非一定有效。即使药物运载系统通过主被动靶向作用到达肿瘤细胞表面，由于载体与靶细胞结合后入胞能力较弱，不能使药物有效地进入肿瘤细胞，降低肿瘤靶向药物的疗效。并且，肿瘤细胞表面受体密度和结合活性可随个体生理、病理条件的变化而改变，受体介导的主动靶向临床疗效并不理想。以TAT为代表的细胞穿膜肽(CPP)细胞膜亲和性高且具有快速穿膜作用，可以将与之相连的大分子、肽段或纳米粒携带入胞。然而，TAT无特异性，对正常细胞也具有很强的穿透作用。利用肿瘤特异性微环境设计响应型释药体系，可实现TAT的保护和去保护，进而发挥其特异性穿膜作用。
　　课题组在国内率先开展PMLA药物载体的研究，结合课题组在聚合物释药体系、智能释放等方面积累，本课题以PMLA为载体、以抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模型，通过化学键合和物理包封两种载药方式制备聚苹果酸前药和载药纳米胶束。共制备了两种形式11种类型的聚苹果酸释药体系，包括聚苹果酸-阿霉素接枝物及其自组装胶束，酸敏感/酶敏感响应型聚苹果酸胶束等。重点研究以PMLA为载体的聚合物药物的载药能力和肿瘤靶向性药物释放行为，并考察其载药性能、稳定性及药物释放性质，系统评价PMLA作为药物载体的应用。引入高效穿膜作用的TAT多肽，考察体系对肿瘤微环境的响应性释放和高效入胞性能。本课题为拓展聚苹果酸作为药物载体的应用奠定基础。本研究共包含三方面内容：
　　第一部分：高载药酸敏感的PMLA-Hz-DOX接枝物
　　PMLA是良好的药物载体材料，PMLA化学键合抗肿瘤药物阿霉素(DOX)得到聚合物-药物接枝物PMLA-Hz-DOX，并研究不同载药率的PMLA-Hz-DOX的自组装行为，结果表明载药率为5%~15%的接枝物在水溶液中能够自组装成为胶束。考察连接PMLA和DOX之间腙键的酸敏感响应性能，探究两者在体外不同pH条件下的释药特点，PMLA-Hz-DOX酸敏感接枝物在pH5.6、6.0、6.8、7.4(分别对应溶酶体、内涵体、肿瘤组织和正常生理pH)下12h药物累积释放率分别为70.00±6.11%、45.64±5.58%、16.04±2.28%、11.89±3.99%，药物释放率随pH的降低而明显增加，说明药物在体循环和肿瘤细胞外较少释放，主要集中在肿瘤细胞内游离。细胞毒性研究结果证实在pH6.0时PMLA-Hz-DOX接枝物的毒性明显高于pH7.4时，主要原因是DOX连接到PMLA上时，发挥抗肿瘤作用的C-13位的羰基与PMLA主链间形成酸敏感的腙键，使其在结合状态时失活，只有腙键断裂、DOX游离，才会发挥抗肿瘤作用。细胞内摄实验证实PMLA-Hz-DOX组接枝物的入胞量大于以酰胺键连接的PMLA-ami-DOX组，由于接枝药物之后还能将PMLA较强的负电性变为正电性，这也有助于提高两组接枝物的细胞摄取。
　　该酸敏感接枝物体系能够实现药物的肿瘤靶向释放，同时，药物释放实验结果显示腙键对肿瘤组织和肿瘤细胞内差异性pH的响应效率不同，在肿瘤组织只能部分断裂，一旦被细胞内摄后则快速释药。
　　第二部分：肿瘤pH响应型高效入胞聚苹果酸胶束
　　抗肿瘤药物递送除需具有肿瘤靶向外还应该实现肿瘤的高效入胞和快速释放，降低毒副作用同时避免药物缓释可能引起的肿瘤耐药，通过物理包封方式载药的聚合物胶束在肿瘤细胞内解体时能够实现药物的集中释放。本部分研究中使用PMLA疏水衍生物聚苹果酸苄基酯(PBM)和PEG形成嵌段聚合物后自组装成为胶束，通过物理包封的方式包载DOX，响应肿瘤细胞内pH胶束解体释放药物。胶束的载药量约为20wt%，比其他聚酯(PLA、PCL等)体系高3-8倍，归因于PBM主链之间及PBM和DOX之间形成π-π堆积作用，且胶束稳定性良好。使用高斯软件模拟PBM之间以及PBM和DOX之间的π-π堆积作用，为其高载药和高稳定性寻找理论支撑。
　　本部分研究中引入具有高效穿膜作用的TAT穿膜肽，基于肿瘤组织特异性的pH条件，利用空间位阻策略设计了通过酸敏感腙键连接长链PEG保护TAT，课题第一部分已经证实腙键在肿瘤组织(pH 6.8)部分断裂，基于此实现TAT的体循环屏蔽和肿瘤去屏蔽。在课题组前期研究基础上，筛选胶束中TAT的比例，连接TAT的嵌段聚合物含量为10%时，有最佳的屏蔽作用且在肿瘤组织能够实现有效去屏蔽效果，有利于实现TAT介导的纳米粒增强入胞作用。
　　对所得空白及载药纳米粒进行表征，结果显示所得纳米粒粒径为80~150nm，形貌圆整，分布均匀，且稳定性良好。考察酸敏感嵌段聚合物的酸敏感断键性能和纳米胶的酸敏感响应行为，结合第一部分研究结果，当pH6.8时，部分(12h约15%)长链PEG离去，暴露TAT，介导胶束高效入胞。体外模拟药物释放实验表明，随着pH值的降低，胶束中DOX的释放明显增加，pH6.0时，药物6h最高释放率接近60%，证实胶束只有被细胞内吞后才能有效释药。体外生物学实验考察不同pH条件下(pH7.4和pH6.0)纳米胶束的入胞性能，结果显示长链PEG能够实现对TAT的有效屏蔽和酸敏感去屏蔽。
　　本部分工作主要采用物理包封形式制备聚苹果酸载药胶束，并利用腙键对肿瘤组织和肿瘤细胞内差异性pH的响应，实现TAT的肿瘤组织去屏蔽和肿瘤细胞内集中释药。皮下荷瘤的裸鼠为动物模型，考察所得纳米胶束的肿瘤抑制情况，长链PEG屏蔽去屏蔽组纳米胶束具有相对较好的肿瘤抑制效果。
　　第三部分：兼有高载药和高效入胞的MMP-2酶敏感型聚苹果酸释药体系
　　第二部分设计的酸敏感体系能够响应肿瘤组织和肿瘤细胞内不同pH实现TAT脱保护和药物释放。但是从药物释放曲线来看，阿霉素并没有像预期的那样集中突释。其原因可能是腙键的断裂速率较慢。由于酶促反应具有高度专一性且灵敏度高响应速度快。同时，肿瘤组织还有特异性的酶环境，所以在这一部分中，我们引入酶特异性裂解多肽pp，实现长链PEG对TAT的屏蔽和去屏蔽。以期实现药物的快速释放。
　　本部分实验中，我们基于肿瘤组织高表达的MMP-2酶引入能够被其特异性裂解的多肽pp，制备MMP-2酶敏感的纳米胶束释药体系，并对其性能进行考察。所得纳米胶束的粒径约130~150nm，且粒度分布均匀，SEM观察所得纳米胶束形貌规整，分散良好。使用DLS对纳米胶束的酶响应性进行考察，结果表明，含有肿瘤酶敏感嵌段聚合物的胶束在肿瘤组织MMP-2酶浓度环境中胶束首先溶胀，然后重构或解体。激光共聚焦实验和流式细胞实验考察纳米胶束的入胞性能，发现有长链PEG保护TAT的纳米胶束在MMP-2浓度为10ng/mL(模拟正常组织酶浓度)时细胞内摄较少；而在MMP-2浓度为100ng/mL(模拟肿瘤组织酶浓度)时，细胞内摄明显增加。以皮下荷瘤的裸鼠为动物模型，考察所得纳米胶束的肿瘤抑制情况，发现所得胶束具有很好的肿瘤抑制效果，且生物安全性较高，避免了直接注射化疗药DOX引起的副作用。综上所述，使用MMP-2酶敏感多肽pp连接的长链PEG保护TAT，能够有较好的屏蔽/去屏蔽效果，且PEG离去后不会降低TAT的穿膜效果，同时，该胶束被细胞内吞后还能在胞内pH作用下迅速释放药物，模拟肿瘤细胞内药物释放实验显示12h药物释放量超过80%。该酶敏感、高效入胞的纳米胶束是一种前景良好的抗肿瘤药物递送体系。
　　本课题以聚苹果酸和阿霉素分别作为载体和抗肿瘤药物模型，以化学键合和物理包封两种载药方式为切入点，设计聚合物前药和纳米胶束，两类共三种聚合物药物，综合考察其载药性能。以肿瘤特异性pH和酶环境为释药“开关”，考察所制备聚合物药物的药物释放行为。并系统研究不同聚苹果酸药物的性质和肿瘤抑制效果。为开发高载药聚苹果酸药物，拓展其在药物载体方面的应用奠定基础。