目的： 探讨重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)肺损伤(acutelung iniury，ALI)时肺表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)、分泌型磷脂酶A2-Ⅱ(secreted phospholipase A2，sPLA2-Ⅱ)的表达，及其在ALI发病中的作用，同时观察肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ cells，AT Ⅱ)在急性胰腺炎肺损伤时的形态及功能改变，并观察清胰汤对SP-A、sPLA2-Ⅱ表达及病情转归的影响。急性重症胰腺炎时增高的sPLA2-Ⅱ对AT Ⅱ细胞损伤作用是引起急性胰腺炎肺损伤的重要因素，急性胰腺炎相关性腹水中sPLA2含量明显增高。本研究进一步行ATⅡ细胞原代培养，用大鼠SAP模型腹水干预细胞，观察细胞增殖状况和生存率改变；并分别应用sPLA2-Ⅱ抑制剂(KH064)、Emodin干预，观察其对腹水预处理AT Ⅱ细胞增殖、SP-A表达的影响，及对细胞形态功能的影响。进一步揭示SP-A、sPLA2 Ⅱ及AT Ⅱ细胞在急性胰腺炎肺损伤发病中的作用，为临床治疗急性肺损伤寻求更为合适的药物作用靶点。 方法： 实验一：采用胆胰管内逆行注入1.5％去氧胆酸钠建立大鼠SAP时ALI模型。将SD大鼠随机分为假手术组(SO组，n=10)、模型组(SAP组，n=10)、清胰汤组(QYT组，n=10)、地塞米松组(DEX组，n=10)、善宁组(SS组，n=101和分泌型磷脂酶A2-Ⅱ抑制剂组(KH064，n=10)。SO组仅行剖腹术，翻动胰腺。QYT组在建立SAP模型后30 min、12h清胰汤灌胃(10 mL/kg)。DEX组于造模后30min、12h静脉注射地塞米松(10mg/kg)。SS组在造模后30min、12h皮下注射善宁(50 μg/kg)。KH064组于造模后30min、12h给予KH064灌胃(5mg/kg)。各组动物在术后24 h测PaO2、PaCO2、pH和血淀粉酶、sPLA2、肺湿/干比。应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肺组织SP-A、sPLA2-Ⅱ mRNA的表达强度，采用Western-bolt检测肺组织SP-A、sPLA2-Ⅱ表达，免疫组化观察肺组织SP-A表达，并观察胰、肺病理变化及ATⅡ细胞的电镜下变化。 实验二：采用Dobbs方法提取AT Ⅱ细胞，首先肺动脉灌洗减少肺内红细胞，肺离体后经气管灌洗除去肺泡腔内的白细胞，将胰蛋白酶、胶原酶灌入肺内消化分离细胞；采用免疫贴附法纯化细胞，巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等细胞表面有IgG的Fc段受体，将细胞悬液培养子覆被IgG的平皿中，有Fc段受体的细胞被粘附，而无Fc段受体的ATⅡ细胞得以纯化。AT Ⅱ细胞的鉴定采用电子显微镜和SP-A免疫组化染色，其在电子显微镜下有特征性板层小体，免疫组化染色见细胞浆有SP-A表达。 实验三：10只雄性SPF SD大鼠，采用胆胰管内逆行注入1.5％去氧胆酸钠建立大鼠SAP时ALI模型，留取腹水，检测腹水sPLA2活性后分装，-80℃保存。按前述方法分离、提取、培养ATⅡ细胞，腹水预处理按腹水终浓度为12.5 μl/ml、25μl/ml、50μl/ml和100μl/ml加入培养液，分6、12、24h三个时点，采用MTT法测定细胞增殖情况和细胞生存率。根据细胞增殖情况，选用腹水预处理浓度为25 μ l/ml，预处理时间24h，培养孔KH064干预终浓度为：0 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml，培养孔Emodin干预终浓度为：0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，用MTT法测定细胞增殖情况，根据实验结果选择药物干预剂量为：KH0641μg/ml、2μg/ml，Emodin 10μg/ml，20μg/ml。腹水预处理组腹水剂量分别为：12.5、25、50、100μl/ml培养液，预处理时间为24h。腹水预处理组和药物干预组分别提取RNA和蛋白，检测SP-AmRNA和蛋白的表达。电子显微镜观察ATⅡ细胞。 结果： SAP组血淀粉酶显著高于SO组和各治疗组(P<0.05)。SAP组PaO2、pH显著低于SO组和治疗组(P<0.05)，SAP组PaCO2、肺W/T显著高于SO组和治疗组(P<0.05)。SAP组血清sPLA2显著高于SO组(P<0.05)，QYT、DEX、KH064组血sPLA2与SAP组比较有显著降低(P<0.05)，SS组血sPLA2与SAP组比较差别无显著性。SAP组SP-A mRNA表达较SO组显著降低(P<0.05)，QYT、DEX、KH064组SP-A mRNA表达较SAP组显著增高(P<0.05)，SS组SP-A mRNA表达与SAP组比较无显著变化。各组SP-AmRNA表达与肺损伤评分呈负相关(P<0.05)。SO组SP-A蛋白有明显表达，与SO组比较，SAP组SP-A表达显著降低，治疗组与SAP组比较SP-A表达增高，其中QYT、DEX、KH064组增高明显。肺组织免疫组化SAP组SP-A表达较SO组显著降低(P<0.05)，各治疗组SP-A表达较SAP组有显著增高(P<0.05)。与SO组比较SAP组sPLA2-Ⅱ mRNA、蛋白表达显著增高，除SS组外其他各治疗组sPLA2-Ⅱ mRNA、蛋白表达较SAP组显著降低。治疗组肺组织病理及电镜改变较SAP组明显好转，以QYT、KH064组好转明显。 纯化前可得约5×108个 ATⅡ细胞/只鼠，IgG免疫粘附纯化后细胞数约为1.6×107个／只。台盼蓝染色显示细胞活力为95％以上。通过SP-A免疫组化染色判定，纯化后ATⅡ细胞纯度可达92％。 光学显微镜检查见随预处理腹水剂量增加，细胞生长状态变差，并出现细胞死亡。KH064、Emodin干预组细胞生长良好。MTT结果显示，腹水呈剂量依赖方式抑制大鼠ATⅡ细胞生长，细胞生存率随培养时间的延长降低。KH064浓度为0.5-2μl/ml时，细胞增殖较对照组明显增高，并呈剂量依赖性；Emodin浓度为10-40 μl/ml时，细胞增殖较对照组有显著增高，并呈剂量依赖性。随着干预腹水浓度的增高，ATⅡ细胞SP-AmRNA的表达降低，表现出明显的剂量依赖性。KH064和Emodin干预组SP-AmRNA的表达水平显著高于对照组(P<0.05)，各干预组不同剂量之间SP-AmRNA的表达水平无显著差别(P>0.05)。腹水预处理组AT Ⅱ细胞SP-A蛋白表达显著低于对照组，并随腹水预处理剂量的增高SP-A的表达降低，呈现剂量依赖性。KH064和Emodin干预组AT Ⅱ细胞SP-A蛋白的表达水平显著高于对照组。KH064和Emodin干预组AT Ⅱ细胞电子显微镜下改变较腹水预处理组明显减轻。 结论： 急性胰腺炎肺损伤时，AT Ⅱ细胞结构破坏，导致SP-AmRNA表达减少，进而使肺表面活性物质中SP-A表达降低，其对sPLA2-Ⅱ抑制作用降低，使后者表达增高，从而加速肺泡表面活性物质磷脂水解，导致肺泡表面张力增加，肺泡萎陷，最终导致ARDS。SP-A和sPLA2-Ⅱ的平衡在急性胰腺炎肺损伤发生中起关键作用。中药清胰汤在急性胰腺炎肺损伤时起保护AT Ⅱ细胞的作用，增加肺组织SP-A表达，同时降低肺组织sPLA2-Ⅱ表达，具有维持肺泡表面活性物质的功能，从而保持良好肺泡表面张力，防止ALI。地塞米松可能通过减轻炎症反应，间接增加肺组织SP-A的表达，降低肺组织sPLA2-Ⅱ的表达，实现保护肺功能的作用。善宁明显降低急性胰腺炎血淀粉酶水平，对SP-A、sPLA2-Ⅱ表达无显著影响。 分离、纯化大鼠AT Ⅱ细胞时，合适的胰蛋白酶浓度及作用时间对细胞活性有重要作用，大鼠IgG粘附纯化可以得到高纯度的AT Ⅱ细胞，可以通过电子显微镜观察板层小体和免疫组化染色检测细胞SP-A表达鉴定ATⅡ细胞。 胰腺炎腹水抑制ATⅡ细胞增殖，随着腹水浓度增高、作用时间延长其对细胞增殖的抑制作用增强，表现出明显剂量、时间依赖性。sPLA2-Ⅱ抑制剂可以减轻腹水对AT Ⅱ细胞的损伤，表明腹水中对细胞损伤起主要作用的物质可能是sPLA2-Ⅱ。Emodin也有减轻腹水对AT Ⅱ细胞的损伤作用，其可能主要通过抑制sPLA2-Ⅱ活性，减轻腹水中sPLA2-Ⅱ对AT Ⅱ细胞的损伤作用而保护细胞功能。 腹水预处理使AT Ⅱ细胞SP-AmRNA、蛋白表达较对照组减少，表明腹水中有抑制SP-A表达物质，应用sPLA2-Ⅱ抑制剂KH064、Emodin可以使SP-A表达增高，表明这两种药物可减轻细胞损伤，通过增加AT Ⅱ细胞SP-A表达而起防止肺损伤的作用。