论文部分内容阅读
KIM-1(肾损伤分子-1,kidney injury molecule-1)是一种新发现的Ⅰ型跨膜蛋白,特征性表达于缺氧损伤后的肾近曲小管上皮细胞顶膜,正是这种特异性使其成为诊断肾缺血缺氧损伤的理想预警分子。但新近研究发现KIM-1还是一种功能分子,参与了肾损伤后的修复过程。KIM-1在去分化肾小管上皮细胞的特异性表达提示可能参与肾小管上皮细胞的去分化、增殖、迁移,促进上皮细胞连续性的重建。体外试验已证实了KIM-1是一种独特的磷脂酰丝氨酸受体,可赋予肾小管上皮细胞吞噬功能,有利于凋亡坏死细胞的清除,减轻小管梗阻。但是,KIM-1的确切功能尚未完全阐明,也无直接证据证实KIM-1的保护功能。从分子结构看,KIM-1作为一种跨膜蛋白其胞外拥有一个6个半胱氨酸组成的免疫球蛋白样功能域和一个富含苏氨酸/丝氨酸的粘蛋白域,其短的胞浆区含一个保守的酪氨酸磷酸化位点,在磷酸酶抑制剂作用下被酪氨酸磷酸化,说明KIM-1可发挥粘附功能并可能激活细胞内信号传导通路。体外试验还发现KIM-1蛋白近膜区可裂解为可溶性KIM-1,这种裂解已是MAPK信号介导的。而MAPK在由多种应激刺激原或炎症因子激活的信号通路中扮演重要角色,并介导细胞生理病理改变,但其在KIM-1裂解功能上的意义尚见报道。根据KIM-1的分子结构,我们推测KIM-1在肾小管缺氧损伤中可能作为一个重要的信号分子,调节肾小管上皮细胞的凋亡/存活,发挥保护肾缺氧损伤的作用。明确KIM-1的功能后,研究其表达调控机制非常关键。从本质上讲肾小管上皮细胞对缺氧的应答是一种氧化应激反应,而KIM-1作为缺氧诱导的肾小管上皮细胞特异性功能基因,其表达必然受到多种应激相关转录因子的调控。缺氧诱导因子-1(HIF-1)作为一种经典的氧依赖性保护性核转录因子,在缺血缺氧应答过程中起着重要的作用。但目前明确的HIF-1靶基因中尚无肾脏特异性表达基因。在预实验中我们发现HIF-1α和KIM-1在HK2细胞缺氧复氧过程密切相关,通过TFsitescan软件辅助启动子分析发现KIM-1基因启动子区含有应激相关转录因子HIF-1的结合位点。我们推测KIM-1在缺氧引起的肾小管上皮细胞损伤中受HIF-1信号通路调节,并作为HIF-1的下游靶基因参与肾损伤及修复过程。本项目以人近端小管上皮细胞(HK2)为对象研究KIM-1这一新的肾脏特异性功能分子在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用及KIM-1胞外功能区裂解在KIM-1抗缺氧损伤中的机制和可能的抗凋亡信号通路。研究KIM-1表达与经典的氧依赖性保护性核转录因子HIF-1的关系,阐明HIF-1对KIM-1的调控机制,为以KIM-1为特异性靶点的肾功能衰竭的治疗提供重要试验依据。主要研究内容及结果如下:第一部分KIM-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用目的:通过稳定表达KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株的建立,观察KIM-1对HK2细胞缺氧损伤后增殖及凋亡的影响,证实KIM-1的保护作用。方法:1.pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株的建立:将获得的pcDNA-hKIM-1质粒进行PCR鉴定,鉴定正确后扩增并转染HK2细胞。用G418培养基对转染的HK2细胞进行反复筛选,获得稳定表达KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株。再用免疫细胞化学、PCR及Western-Blot对转染的HK2细胞鉴定,确定pcDNA-hKIM-1-HK2细胞高表达KIM-1。2. KIM-1对缺氧诱导HK2细胞凋亡的保护效应:观察pcDNA-hKIM-1-HK2、HK2和KIM-1抗体预处理的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞在缺氧损伤中细胞形态、细胞活力及凋亡指标,确定KIM-1表达对HK2细胞缺氧损伤的保护效应。结果1.质粒鉴定结果显示在100bp左右扩增出一明亮条带,与理论碱基对吻合,质粒鉴定正确。免疫细胞化学鉴定提示KIM-1表达定位于细胞膜,PCR及Western-Blot提示转染的HK2细胞高表达KIM-1。2. pcDNA-hKIM-1-HK2细胞具有明显的抗缺氧损伤作用,细胞增殖活力高于对照组,细胞凋亡数量及流式细胞仪检测的缺氧早、中、晚期凋亡指数明显低于对照组(p<0.01)。第二部分可溶性KIM-1裂解抗肾小管上皮细胞缺氧损伤的作用机制目的:明确KIM-1胞外功能区裂解在KIM-1抗缺氧损伤功能中的机制,探讨这种裂解功能对凋亡相关信号分子的影响。方法:1. ELISA法检测pcDNA-hKIM-1-HK2、缺氧及正常HK2细胞培养基中可溶性KIM-1裂解形式含量以及KIM-1抗体对可溶性KIM-1表达的影响,观察KIM-1的胞外功能区裂解功能。2.使用p38MAPK抑制剂SB203580阻断KIM-1裂解功能后观察pcDNA- hKIM-1- HK2细胞在缺氧损伤中细胞形态、细胞活力及凋亡指标,确定KIM-1胞外功能区裂解是KIM-1保护细胞缺氧损伤的机制。3. Western-blot检测不同剂量p38MAPK抑制剂预处理后的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞缺氧时ERK、p38MAPK、JNK、AKT的变化,明确KIM-1胞外功能区裂解对抗细胞损伤可能的抗凋亡信号机制。结果1. pcDNA-hKIM-1-HK2和缺氧的HK2细胞膜高表达KIM-1,在细胞培养基中检测到可溶性KIM-1存在,说明膜型KIM-1可通过胞外功能区的裂解功能向培养基中释放可溶性裂解形式。2. p38MAPK抑制剂SB203580可抑制KIM-1的裂解功能,并抑制KIM-1介导的抗缺氧损伤作用。p38MAPK抑制剂预处理的HK2细胞增殖活力低于对照组,细胞凋亡数量及流式细胞仪检测的缺氧早、中、晚期凋亡指数明显高于对照组(p<0.01),而且这种作用呈剂量依赖性。3. p38MAPK抑制剂预处理的HK2细胞缺氧损伤时,ERK、AKT的表达量无明显变化,但磷酸化的ERK、AKT显著降低,P38,JNK的磷酸化也有所降低,但其变化没有ERK和AKT显著。可溶性KIM-1可能通过PI3K-AKt/PKB通路和ERK通路来抑制细胞凋亡。第三部分KIM-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中表达的HIF-1信号通路调节目的:观察HK2细胞缺氧损伤过程中KIM-1和HIF-1α表达的相关性及HIF-1α表达对KIM-1表达的影响。通过ChIP和EMSA验证HIF-1与KIM-1基因启动子区结合情况,证实KIM-1的表达受HIF-1信号通路调节。方法:1. Real Time RT-PCR和Western-blot检测HK2细胞缺氧复氧不同时段KIM-1、HIF-1αmRNA和蛋白水平表达,免疫荧光双标染色法在激光共聚焦显微镜下观察KIM-1和HIF-1α在HK2细胞的表达定位,确定KIM-1与HIF-1α表达相关性。2. HIF-1α激动剂CoCl2和抑制剂Rapamycin预处理HK2细胞,观察上调或下调HIF-1表达对KIM-1 mRNA和蛋白水平的影响,确定HIF-1对KIM-1的调节作用。3. KIM-1启动子与HIF-1α结合位点的检测:将缺氧的HK2细胞染色质-HIFα蛋白通过ChIP试剂盒免疫共沉淀。根据预测的KIM-1启动子区与HIF-1α结合位点的序列设计引物,用Real Time RT-PCR检测结合位点的存在。4. KIM-1启动子与HIF-1α结合能力检测:以KIM-1启动子区的HRE位点为模板,设计3’端Biotin标记的双链寡核苷酸探针,用EMSA检测HK2细胞缺氧损伤不同时段探针与HIF-1α的结合动力变化。同时观察用CoCl2和Rapamycin上调或下调HIF-1α表达对这种结合动力的影响。结果1. HK2细胞缺氧过程中KIM-1和HIF-1α蛋白和基因水平表达同步升高,在复氧过程中同步下降,说明KIM-1和HIF-1α的表达密切相关。免疫细胞化学提示KIM-1和HIF-1α共表达于缺氧的HK2细胞,KIM-1表达于细胞膜,HIF-1α表达于细胞核。2. CoCl2和Rapamycin可上调或下调HIF-1α表达,并因此促进或抑制KIM-1的表达(p<0.01),而且这种调节作用呈剂量依赖性。3. HK2细胞缺氧后以KIM-1启动子的HIF-1α结合位点设计引物扩增的片段出现在227bp,与预计符合。而未缺氧的HK2细胞未检测出KIM-1启动子与HIF-1α的结合位点。说明KIM-1启动子区含有与HIF-1α结合的位点,这种结合是以缺氧为条件的。4.以KIM-1启动子区HRE位点为模板设计的双链寡核苷酸探针在HK2细胞缺氧损伤过程中与HIF-1α结合,上调或下调HIF-1α表达可分别促进或抑制这种结合能力。结论:综上所述,本研究用体外实验证实了KIM-1对缺氧诱导HK2细胞损伤的保护效应,这种保护效应通过p38-MAPK途径对KIM-1胞外功能区的裂解,从而激活下游PI3K-AKt/PKB和ERK通路,促进AKT、ERK的磷酸化,实现促进细胞增殖及抗凋亡作用。而且KIM-1在HK2细胞缺氧损伤中的表达受HIF-1调控,KIM-1是作为HIF-1的下游分子参与肾小管缺氧后的修复过程。