非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A、B单克隆抗体的制备与鉴定

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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的猪的重要传染病之一,临床上主要表现为妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。目前,PRRS已遍及全球主要养猪国家和地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV进入细胞的过程是依赖受体实现的,目前已鉴定的PRRSV的细胞受体有4个:硫酸乙酞肝素HS、唾液酸粘附素Sn、CD163及波形蛋白Vimentin。HS主要是吸附PRRSV到易感细胞上,Sn介导PRRSV的内吞,CD163协助Sn内吞并介导PRRSV复制的脱衣壳、释放过程,Vimentin与其它中间丝蛋白组成多聚体参与PRRSV在细胞内的复制和迁移。非肌肉肌球蛋白II型(Nonmuscle myosin II, NM-II)广泛存在于肌细胞和非肌细胞中,在细胞迁移、细胞吸附、胞质分裂及胞内物质运输等发挥着重要的作用。非肌肉肌球蛋白II型重链(Nonmuscle myosin heavy chain II, NMHC-II)可分3种亚型:NMHCII-A、NMHC II-B和NMHC II-C,三者氨基酸同源性达60%-80%的,但其氨基端和羧基端氨基酸序列存在明显差异,可据此制备特异性抗体识别不同亚型。本实验室利用PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体(MAb2-5G2)在Marc-145细胞中检测到NMHCII-A并进行探究,研究结果证明NMHC II-A羧基端蛋白可以降低PRRSV对Marc-145细胞的感染力,而NMHC II-B羧基端蛋白能够显著增强PRRSV感染细胞。这些研究结果表明:NMHC II-A、NMHC II-B在PRRSV感染Marc-145细胞过程中发挥作用。本研究通过蛋白纯化、免疫BALB/c小鼠、细胞融合与亚克隆技术,成功获得了针对NMHC II-A及NMHC II-B羧基端蛋白的单克隆抗体,均属于IgG亚类。这些单克隆抗体对相应抗原表现出高度特异性,相互之间不存在交叉反应。I-ELISA和western blot结果确定NMHC II-A的单克隆抗体结合域在NMHC II-A1812-1894AA处,NMHC II-B的单克隆抗体抗原结合域在NMHC II-B1759-1903AA处;叠加ELISA实验显示各单克隆抗体的抗原结合表位相同或相近。通过制备小鼠腹水和抗体纯化技术,获得纯化单克隆抗体进行细胞实验。间接免疫荧光实验表明单克隆抗体可以结合Marc-145细胞上的活性抗原,不同剂量的单克隆抗体与Marc-145细胞的结合力度与其浓度成正比:剂量越大,荧光信号越强。免疫沉淀实验进一步证实了单克隆抗体的生物活性。NMHC II-A及NMHCII-B羧基端蛋白单克隆抗体的制备为探究NMHC II-A、NMHC II-B与PRRSV之间的具体关系奠定了基础。
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