论文部分内容阅读
【目的】
1.制备包裹白介素12(IL-12)的还原响应性白蛋白纳米颗粒(INS)，采用生物正交反应(Bioorthogonal reaction)偶联策略，研制一种免疫刺激剂工程化的CART细胞(INS-CAR T)，对其进行理化性质表征。
2.对INS-CART细胞进行体外细胞学实验，考察INS-CART细胞抗原触发还原响应释放药物的特性，以及IL-12从INS中响应释放后对CART细胞功能活性的促进作用。
3.对INS-CART细胞进行体内评价，研究INS-CART细胞在小鼠肿瘤部位的多级反馈体系，评估INS-CART细胞的免疫治疗效果和生物安全性，并探究其作用机制。
【方法】
1.通过人血清白蛋白(HSA)分子间二硫键重构制备还原响应性的INS，并利用生物相容性HSA包封免疫刺激剂白介素12(IL-12)，然后进行二苯并环辛基(DBCO)标记。与糖代谢标记叠氮(N3)的CART细胞通过有效的DBCO/N3生物正交反应制得INS-CART。采用巯基检测试剂盒检测INS的游离巯基；采用动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)，透射电镜(Transmission electron microscopy，TEM)，IL-12酶联免疫试剂盒(ELISA)分别检测INS的粒径、形貌和还原响应药物释放特性进行表征；通过共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)和扫描电镜(Scanning electron microscopy， SEM)综合分析CART细胞表面INS的偶联效率。以CD19+B淋巴瘤细胞系Raji细胞为靶细胞，评价INS的偶联对CART细胞靶向性、细胞活性、分型和杀伤功能的影响。
2.以Raji细胞为靶细胞，在引入抗原后，采用巯基检测试剂盒，SEM，ELISA等技术综合考察CART细胞表面游离巯基水平并绘制IL-12释放曲线；采用流式细胞术，ELISA检测，乳酸脱氢酶(LDH)释放法及生物发光成像等技术综合评价IL-12累积释放量对CART细胞增殖、抗肿瘤细胞因子分泌以及肿瘤细胞杀伤功能的促进作用；以Raji培育的3D细胞球作为体外肿瘤组织模型，使用CLSM和活/死细胞染色实验分析INS-CART细胞对Raji细胞球的浸润能力和杀伤能力。
3.以荷Raji细胞移植瘤的NOD/SCID小鼠为研究对象，采用小动物活体成像系统检测CART细胞和INS的荧光分布及肿瘤细胞荧光素酶的表达水平，进而监测INS-CART细胞在肿瘤和各脏器中的分布和富集情况，以及肿瘤的发生与发展；测量肿瘤体积、体重评价INS-CART细胞抑瘤的疗效；考察肿瘤组织中CART细胞、IL-12、抗肿瘤细胞因子、趋化因子以及各种固有免疫细胞的浓度，并探讨INS-CART细胞抑瘤的作用机制；考察血液生化指标和器官组织形态学差异，评估INS-CART细胞的体内生物安全性。
【结果】
1.INS-CART细胞的制备和表征：游离巯基检测结果显示INS的制备过程伴随着游离巯基浓度的变化。制备的INS呈近似球形，均一性较好，大小为(50±4)nm。IL-12释放曲线表明INS具有还原响应性。CLSM、流式细胞术和SEM结果表明INS通过生物正交反应成功、高效地偶联到CART细胞表面。INS在CART细胞表面的成功偶联不会影响CART细胞的基本功能活性。
2.体外生物学分析：在引入抗原后，巯基检测结果显示CART细胞膜表面表达更高的游离巯基水平。SEM、ELISA检测表明CART细胞表面的INS会因为抗原的引入而加速裂解并释放IL-12。同时，对比CART细胞，INS-CART细胞的增殖功能、抗肿瘤细胞因子分泌量以及对靶细胞的杀伤能力均显著提高。另外，在以3D细胞球作为体外肿瘤组织模型的实验中，相比于CART细胞，INS-CART细胞具有更强的浸润和杀伤能力。
3.体内实验结果评价：尾静脉注射后，INS-CART细胞能有效地将INS递送到肿瘤部位。INS-CART细胞抑瘤疗效显著，并提高小鼠的存活率至100%。对肿瘤组织生化分析，INS-CART细胞能有效浸润到肿瘤深层组织并通过体内抗原触发的还原响应性释放IL-12。同时，肿瘤趋化因子、抗肿瘤细胞因子和活化固有免疫细胞表达量显著增多。器官组织形态学和血液生化指标评估，仅IL-12+CART细胞显示出肝毒性，表明INS-CART细胞体系能降低IL-12对肝脏的毒性作用，具有更高的安全性。
【结论】
1.成功制备了包载免疫刺激剂IL-12的肿瘤还原响应性INS，INS通过生物正交反应高效无损地偶联在CART细胞表面制得免疫刺激剂工程化的CART细胞(INS-CAR T)。
2.在抗原条件下，INS-CART细胞上的INS会响应性释放出IL-12，而IL-12能刺激CART细胞增强其抗肿瘤疗效。
3.在INS-CART体系中，INS能通过CART细胞的靶向识别精准地递送至肿瘤部位，通过多级反馈响应作用既能增强CART细胞对肿瘤的抑制作用，又能降低游离IL-12对肝脏的毒副作用。
1.制备包裹白介素12(IL-12)的还原响应性白蛋白纳米颗粒(INS)，采用生物正交反应(Bioorthogonal reaction)偶联策略，研制一种免疫刺激剂工程化的CART细胞(INS-CAR T)，对其进行理化性质表征。
2.对INS-CART细胞进行体外细胞学实验，考察INS-CART细胞抗原触发还原响应释放药物的特性，以及IL-12从INS中响应释放后对CART细胞功能活性的促进作用。
3.对INS-CART细胞进行体内评价，研究INS-CART细胞在小鼠肿瘤部位的多级反馈体系，评估INS-CART细胞的免疫治疗效果和生物安全性，并探究其作用机制。
【方法】
1.通过人血清白蛋白(HSA)分子间二硫键重构制备还原响应性的INS，并利用生物相容性HSA包封免疫刺激剂白介素12(IL-12)，然后进行二苯并环辛基(DBCO)标记。与糖代谢标记叠氮(N3)的CART细胞通过有效的DBCO/N3生物正交反应制得INS-CART。采用巯基检测试剂盒检测INS的游离巯基；采用动态光散射(Dynamic light scattering，DLS)，透射电镜(Transmission electron microscopy，TEM)，IL-12酶联免疫试剂盒(ELISA)分别检测INS的粒径、形貌和还原响应药物释放特性进行表征；通过共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)和扫描电镜(Scanning electron microscopy， SEM)综合分析CART细胞表面INS的偶联效率。以CD19+B淋巴瘤细胞系Raji细胞为靶细胞，评价INS的偶联对CART细胞靶向性、细胞活性、分型和杀伤功能的影响。
2.以Raji细胞为靶细胞，在引入抗原后，采用巯基检测试剂盒，SEM，ELISA等技术综合考察CART细胞表面游离巯基水平并绘制IL-12释放曲线；采用流式细胞术，ELISA检测，乳酸脱氢酶(LDH)释放法及生物发光成像等技术综合评价IL-12累积释放量对CART细胞增殖、抗肿瘤细胞因子分泌以及肿瘤细胞杀伤功能的促进作用；以Raji培育的3D细胞球作为体外肿瘤组织模型，使用CLSM和活/死细胞染色实验分析INS-CART细胞对Raji细胞球的浸润能力和杀伤能力。
3.以荷Raji细胞移植瘤的NOD/SCID小鼠为研究对象，采用小动物活体成像系统检测CART细胞和INS的荧光分布及肿瘤细胞荧光素酶的表达水平，进而监测INS-CART细胞在肿瘤和各脏器中的分布和富集情况，以及肿瘤的发生与发展；测量肿瘤体积、体重评价INS-CART细胞抑瘤的疗效；考察肿瘤组织中CART细胞、IL-12、抗肿瘤细胞因子、趋化因子以及各种固有免疫细胞的浓度，并探讨INS-CART细胞抑瘤的作用机制；考察血液生化指标和器官组织形态学差异，评估INS-CART细胞的体内生物安全性。
【结果】
1.INS-CART细胞的制备和表征：游离巯基检测结果显示INS的制备过程伴随着游离巯基浓度的变化。制备的INS呈近似球形，均一性较好，大小为(50±4)nm。IL-12释放曲线表明INS具有还原响应性。CLSM、流式细胞术和SEM结果表明INS通过生物正交反应成功、高效地偶联到CART细胞表面。INS在CART细胞表面的成功偶联不会影响CART细胞的基本功能活性。
2.体外生物学分析：在引入抗原后，巯基检测结果显示CART细胞膜表面表达更高的游离巯基水平。SEM、ELISA检测表明CART细胞表面的INS会因为抗原的引入而加速裂解并释放IL-12。同时，对比CART细胞，INS-CART细胞的增殖功能、抗肿瘤细胞因子分泌量以及对靶细胞的杀伤能力均显著提高。另外，在以3D细胞球作为体外肿瘤组织模型的实验中，相比于CART细胞，INS-CART细胞具有更强的浸润和杀伤能力。
3.体内实验结果评价：尾静脉注射后，INS-CART细胞能有效地将INS递送到肿瘤部位。INS-CART细胞抑瘤疗效显著，并提高小鼠的存活率至100%。对肿瘤组织生化分析，INS-CART细胞能有效浸润到肿瘤深层组织并通过体内抗原触发的还原响应性释放IL-12。同时，肿瘤趋化因子、抗肿瘤细胞因子和活化固有免疫细胞表达量显著增多。器官组织形态学和血液生化指标评估，仅IL-12+CART细胞显示出肝毒性，表明INS-CART细胞体系能降低IL-12对肝脏的毒性作用，具有更高的安全性。
【结论】
1.成功制备了包载免疫刺激剂IL-12的肿瘤还原响应性INS，INS通过生物正交反应高效无损地偶联在CART细胞表面制得免疫刺激剂工程化的CART细胞(INS-CAR T)。
2.在抗原条件下，INS-CART细胞上的INS会响应性释放出IL-12，而IL-12能刺激CART细胞增强其抗肿瘤疗效。
3.在INS-CART体系中，INS能通过CART细胞的靶向识别精准地递送至肿瘤部位，通过多级反馈响应作用既能增强CART细胞对肿瘤的抑制作用，又能降低游离IL-12对肝脏的毒副作用。