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【目的】
1.研究高糖对MG63细胞成骨分化的抑制作用。
2.探讨HIF1A-AS1在高糖抑制MG63细胞成骨分化中的作用及机制。
【方法】
1.MTT法检测高糖对人成骨肉瘤MG63细胞体外增殖的影响。分组：25mM糖浓度(对照组)、50mM糖浓度组、75mM糖浓度组、100mM糖浓度组、125mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度条件下培养细胞1天、3天、5天、7天后检测各组细胞活力。
2.碱性磷酸酶染色法和PNPP法检测人成骨肉瘤MG63细胞的成骨分化情况。
2.1高糖对人成骨肉瘤MG63细胞成骨分化的影响。分组：25mM糖浓度组(对照组)、50mM糖浓度组、75mM糖浓度组、100mM糖浓度组、125mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度条件下培养细胞3天、5天、7天、9天后检测各组细胞碱性磷酸酶水平。
2.2高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1基因对人成骨肉瘤MG63细胞成骨分化的影响。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理7天后检测各组细胞碱性磷酸酶水平。
3.茜素红染色法检测人成骨肉瘤MG63细胞骨矿化水平。
3.1高糖对人成骨肉瘤MG63细胞矿化的影响。分组：25mM糖浓度组(对照组)、50mM糖浓度组、75mM糖浓度组、100mM糖浓度组、125mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度处理9天、11天、13天后进行茜素红染色，观察各组细胞钙结节形成情况。
3.2高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1基因对骨矿化的影响。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理9天后进行茜素红染色，观察各组细胞钙结节形成情况。
4.RT-qPCR方法检测基因表达情况
4.1高糖环境下成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX及HIF1A-AS1的表达情况。分组：25mM糖浓度组(对照组)、50mM糖浓度组、100mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度条件下培养细胞3天、7天、11天后检测各细胞中基因表达情况。
4.2高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1基因对成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX、hsa-miR-3658、FZD3和β-catenin表达的影响。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理7天后检测各基因表达情况。
5.Westernblot检测高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1后FZD3和β-catenin蛋白表达水平。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理7天后检测蛋白表达情况。
【结果】
1.MTT结果显示，MG63细胞在高糖条件下，从第3天开始细胞增殖受到抑制，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，且具有剂量和时间依赖关系。
2.PNPP和碱性磷酸酶染色结果显示，PNPP结果显示高糖培养条件能明显抑制细胞的ALP活性(P＜0.05)，且呈剂量和时间依赖关系。与对照组相比，高糖组ALP染色较浅，糖浓度越高染色越浅，150mM糖浓度组染色最浅。高糖培养条件下，过表达HIF1A-AS1后，与对照组相比ALP活性降低(P＜0.05)， 而沉默HIF1A-AS1后细胞ALP活性增加(P＜0.05)。
3.茜素红染色结果显示，与对照组相比，高糖培养条件下MG63细胞矿化结节染色较浅；沉默HIF1A-AS1后能对抗高糖引起的MG63细胞的矿化抑制；而过表达HIF1A-AS1后MG63细胞的矿化染色变浅。
4.与对照组相比，高糖组中MG63细胞成骨细胞因子Runx2、ALP、OCN、OSX的表达下调(P＜0.05)，且HIF1A-AS1的表达随着糖浓度的增加而增高(P＜0.05)。在高糖培养条件下，沉默HIF1-AS1后成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX的表达上升，hsa-miR-3658、FZD3、β-cateninmRNA表达增加(P＜0.05)；HIF1-AS1过表达组中，成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX的表达下调，且hsa-miR-3658、FZD3、β-cateninmRNA表达下降(P＜0.05)。
5.在高糖培养条件下，与对照组相比，HIF1A-AS1沉默组中FZD3和β-catenin蛋白表达增加，HIF1A-AS1过表达组中FZD3、β-catenin蛋白表达减少(P＜0.05)。
【结论】
1.高糖能抑制MG63的体外增殖和成骨分化。
2.HIF1A-AS1参与了高糖对MG63成骨分化的抑制作用。
3.HIF1A-AS1/hsa-miR-3658/FZD3/β-catenin信号通路可能是高糖抑制MG63成骨分化的潜在机制。
1.研究高糖对MG63细胞成骨分化的抑制作用。
2.探讨HIF1A-AS1在高糖抑制MG63细胞成骨分化中的作用及机制。
【方法】
1.MTT法检测高糖对人成骨肉瘤MG63细胞体外增殖的影响。分组：25mM糖浓度(对照组)、50mM糖浓度组、75mM糖浓度组、100mM糖浓度组、125mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度条件下培养细胞1天、3天、5天、7天后检测各组细胞活力。
2.碱性磷酸酶染色法和PNPP法检测人成骨肉瘤MG63细胞的成骨分化情况。
2.1高糖对人成骨肉瘤MG63细胞成骨分化的影响。分组：25mM糖浓度组(对照组)、50mM糖浓度组、75mM糖浓度组、100mM糖浓度组、125mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度条件下培养细胞3天、5天、7天、9天后检测各组细胞碱性磷酸酶水平。
2.2高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1基因对人成骨肉瘤MG63细胞成骨分化的影响。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理7天后检测各组细胞碱性磷酸酶水平。
3.茜素红染色法检测人成骨肉瘤MG63细胞骨矿化水平。
3.1高糖对人成骨肉瘤MG63细胞矿化的影响。分组：25mM糖浓度组(对照组)、50mM糖浓度组、75mM糖浓度组、100mM糖浓度组、125mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度处理9天、11天、13天后进行茜素红染色，观察各组细胞钙结节形成情况。
3.2高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1基因对骨矿化的影响。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理9天后进行茜素红染色，观察各组细胞钙结节形成情况。
4.RT-qPCR方法检测基因表达情况
4.1高糖环境下成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX及HIF1A-AS1的表达情况。分组：25mM糖浓度组(对照组)、50mM糖浓度组、100mM糖浓度组、150mM糖浓度组。不同糖浓度条件下培养细胞3天、7天、11天后检测各细胞中基因表达情况。
4.2高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1基因对成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX、hsa-miR-3658、FZD3和β-catenin表达的影响。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理7天后检测各基因表达情况。
5.Westernblot检测高糖培养条件下过表达和沉默HIF1A-AS1后FZD3和β-catenin蛋白表达水平。分组：空转组(对照组)、空转+100mM糖浓度组、HIF1A-AS1转染组(沉默或过表达)、HIF1A-AS1转染+100mM糖浓度组。分组处理7天后检测蛋白表达情况。
【结果】
1.MTT结果显示，MG63细胞在高糖条件下，从第3天开始细胞增殖受到抑制，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，且具有剂量和时间依赖关系。
2.PNPP和碱性磷酸酶染色结果显示，PNPP结果显示高糖培养条件能明显抑制细胞的ALP活性(P＜0.05)，且呈剂量和时间依赖关系。与对照组相比，高糖组ALP染色较浅，糖浓度越高染色越浅，150mM糖浓度组染色最浅。高糖培养条件下，过表达HIF1A-AS1后，与对照组相比ALP活性降低(P＜0.05)， 而沉默HIF1A-AS1后细胞ALP活性增加(P＜0.05)。
3.茜素红染色结果显示，与对照组相比，高糖培养条件下MG63细胞矿化结节染色较浅；沉默HIF1A-AS1后能对抗高糖引起的MG63细胞的矿化抑制；而过表达HIF1A-AS1后MG63细胞的矿化染色变浅。
4.与对照组相比，高糖组中MG63细胞成骨细胞因子Runx2、ALP、OCN、OSX的表达下调(P＜0.05)，且HIF1A-AS1的表达随着糖浓度的增加而增高(P＜0.05)。在高糖培养条件下，沉默HIF1-AS1后成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX的表达上升，hsa-miR-3658、FZD3、β-cateninmRNA表达增加(P＜0.05)；HIF1-AS1过表达组中，成骨相关基因Runx2、ALP、OCN、OSX的表达下调，且hsa-miR-3658、FZD3、β-cateninmRNA表达下降(P＜0.05)。
5.在高糖培养条件下，与对照组相比，HIF1A-AS1沉默组中FZD3和β-catenin蛋白表达增加，HIF1A-AS1过表达组中FZD3、β-catenin蛋白表达减少(P＜0.05)。
【结论】
1.高糖能抑制MG63的体外增殖和成骨分化。
2.HIF1A-AS1参与了高糖对MG63成骨分化的抑制作用。
3.HIF1A-AS1/hsa-miR-3658/FZD3/β-catenin信号通路可能是高糖抑制MG63成骨分化的潜在机制。