随着西部大开发战略的实施和高原旅游热的兴起,进入高海拔低氧环境地区的人越来越多。人快速进入3000m以上高原会因缺氧发生以呼吸、消化和中枢神经系统症状为主的急性高原反应,严重者会发展为高原肺水肿(high altitude pulmonary edema, HAPE)和/或高原脑水肿(high altitude cerebral edema, HACE)。低氧是高原环境最主要的特征,可引起人体一系列生理机能的改变,而且低氧是许多疾病如休克、癌症、免疫性疾病发生发展过程中最基本的病理环节。以往国内外对高原医学和低氧生理学的研究多集中在呼吸、循环、中枢神经、运动等系统,而高原低氧所引起的免疫损伤一直未引起足够的重视。流行病学资料显示,高原居民肺部感染有增加的倾向,高海拔兵站士兵比低海拔士兵易患肺炎,高原土著居民婴儿肺炎的发病率和死亡率大大增加,高原患病毒性感冒更易发展为高原肺水肿。这些提示低氧可能损伤机体的防御功能,增加机体对疾病的易感性,促进高原病的发生发展。这将严重影响进驻高原者的身体健康和高原作业效率,是亟待需要解决的问题。因此高海拔低氧环境机体免疫损伤的病理生理学及其防治措施的研究越来越受到关注。本实验采用经典的低压低氧的方法,模拟海拔8000m,分别低氧暴露不同时间,观察机体非特异性细胞免疫功能、特异性细胞免疫功能、体液免疫功能、免疫器官指数的变化,针对变化敏感的指标进一步研究低氧免疫损伤的特点,并从淋巴细胞活化、淋巴细胞凋亡和淋巴细胞重要脏器是否重新分布三个方面分析低氧免疫损伤的可能机制。在此基础上应用本室现有的耐缺氧药物新复方党参片和免疫调节剂泰康胶囊,采用预防给药的方式,研究中药组方对机体免疫损伤的干预作用。一、高原低氧暴露对免疫系统功能的影响模拟海拔8000m,分别低氧暴露8h、6d和10d,观察在低氧暴露期间小鼠巨噬细胞的吞噬功能、脾T淋巴细胞的增殖功能、迟发型超敏反应强度、脾B淋巴细胞增殖功能及免疫器官指数的变化。研究结果显示模拟海拔8000m低氧暴露8h后,小鼠校正廓清指数(碳廓清实验)较对照组显著增加(P<0.05)。低氧暴露6d和10d后,小鼠耳廓肿胀度(迟发型超敏反应),低氧组较常氧对照组显著减轻(P<0.01, P<0.05);小鼠脾T淋巴细胞在有丝分裂原(ConA)作用下的增殖能力,低氧组较常氧对照组显著降低(P<0.05);小鼠脾脏较常氧对照组明显增大,脾指数显著性增加(P<0.01);小鼠胸腺较常氧对照组明显减小,胸腺指数显著性降低(P<0.01)。整个低氧暴露过程脾B淋巴细胞增殖功能未见显著性变化。以上研究结果表明低氧暴露早期,机体特异性细胞免疫和免疫器官(胸腺和脾脏)损伤显著。二、高原低氧损伤免疫系统的特征及其机制研究模拟海拔8000m,分别低氧暴露8h、3d和6d,从外周血、脾脏和胸腺淋巴细胞亚群(CD3、CD4、CD8、CD19)方面研究低氧暴露损伤免疫系统的特征,并从三个方面探讨低氧免疫损伤的可能机制。(一)低氧暴露对外周血、脾脏和胸腺淋巴细胞亚群的影响模拟海拔8000m低氧暴露8h后,小鼠外周血CD3+细胞数显著降低(P<0.01),CD19+细胞显著增加(P<0.01),胸腺CD4+CD8+细胞数显著下降(P<0.01),CD4+CD8-、CD4-CD8+细胞数显著增加(P<0.01);低氧暴露3d后,外周血CD4+细胞也明显减少(P<0.05),CD4+/CD8+比值显著降低(P<0.05),CD19+细胞进一步增加(P<0.05),胸腺CD4+CD8+细胞数进一步下降(P<0.01),CD4+CD8-、CD4-CD8+细胞数进一步增加(P<0.01);低氧暴露6d后,外周血CD3+、CD4+细胞数减少更加明显(P<0.01),CD4+/CD8+比值进一步下降(P<0.01),脾CD3+、CD4+、CD8+细胞数显著降低(P<0.01)。整个低氧暴露过程中外周血CD8+和脾脏CD19+细胞数无显著性变化。说明模拟海拔8000m低氧暴露6d后,小鼠出现以辅助性T淋巴细胞(CD4+)显著降低为主的细胞免疫功能紊乱,同时中枢免疫器官胸腺产生成熟淋巴细胞的功能降低。(二)低氧暴露对外周血淋巴细胞活化的影响模拟海拔8000m低氧暴露8h后,大鼠CD3+、CD8+、CD8+CD28-细胞数显著降低(P<0.01);低氧暴露3d后,除上述指标外,CD4+CD28+细胞数显著降低(P<0.01),CD4+CD28-细胞数显著增加(P<0.01),CD8+CD28-细胞数有所恢复;低氧暴露6d和10d后,CD3+、CD4+呈现进一步降低趋势,CD8+CD28+细胞数显著增加(P<0.01)。说明模拟海拔8000m低氧暴露8h和3d后,大鼠外周血CD8+、CD4+ T淋巴细胞活化水平均显著下降,随着低氧暴露时间的延长,CD8+T淋巴细胞活化水平由降低变为增加。(三)低氧暴露对外周血、脾脏、胸腺淋巴细胞凋亡的影响根据凋亡早期细胞细胞膜的变化,采用Annexin V/PI方法,测定结果表明模拟海拔8000m低氧暴露3d后,小鼠脾脏、胸腺淋巴细胞晚期凋亡和坏死率均显著增加(P<0.05);低氧暴露6d后,脾脏和胸腺淋巴细胞晚期凋亡率和坏死率进一步增加(P<0.01),活细胞率显著降低(P<0.01),脾脏淋巴细胞早期凋亡率显著增加(P<0.01)。说明模拟海拔8000m低氧暴露6d后,小鼠胸腺和脾脏发挥免疫作用的淋巴细胞显著减少,淋巴细胞的晚期凋亡率和坏死率显著增加。应用死亡因子Fas标记淋巴细胞,测定结果表明模拟海拔8000m低氧暴露8h后,小鼠外周血和脾脏CD3+CD95+细胞数显著下降(P<0.01),低氧暴露6d后,小鼠外周血和脾脏CD3+CD95+细胞数进一步下降(P<0.05)。说明模拟海拔8000m低氧暴露6d后,小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞凋亡率显著降低。模拟海拔8000m低氧暴露6d后,小鼠外周血和脾脏CD19+CD95+细胞数显著增加(P<0.05)。说明模拟海拔8000m低氧暴露6d后,小鼠外周血B淋巴细胞凋亡率显著性增加。(四)低氧暴露对重要脏器形态学的影响模拟海拔8000m低氧暴露8h后,镜下观察,肺泡腔中有少量红细胞;低氧暴露3d后,除了红细胞外,肺泡中有单核细胞浸润;低氧暴露6d后,肉眼观察表明,肺叶部分充血呈暗红色。镜下观察少量肺泡腔中存在粉红色渗出液。小鼠肾脏充血增加。说明模拟海拔8000m低氧暴露6d后,肺脏和肾脏有明显损伤,且肺脏存在淋巴细胞分布增多现象。三、高原低氧免疫损伤干预措施的研究根据前期试验结果,选择模拟海拔8000m低氧暴露6d作为建立低氧免疫损伤动物模型的条件,采用预防给药的方式,探讨现有中药组方对低氧免疫损伤小鼠是否有调节作用。(一)泰康胶囊、新复方党参片及二者联合应用对小鼠缺氧耐力的调节作用泰康胶囊各剂量组小鼠存活时间均较对照组有显著性差异(P<0.05, P<0.01),且存在着剂量-效应关系(r=0.99),说明泰康胶囊有增加机体缺氧耐力的作用。新复方党参片在50mg/kg剂量下可显著增加小鼠密闭缺氧的存活时间(P<0.05),并且随着剂量的增加,小鼠的密闭缺氧存活时间延长。中等剂量的新复方党参片和低剂量的泰康胶囊联合应用,对小鼠缺氧耐力的调节作用具有协同效应,小鼠密闭缺氧的存活时间明显长于单独给药(P<0.01),说明免疫调节剂泰康胶囊与耐缺氧药物新复方党参片联合应用,可显著增加机体的耐缺氧能力。(二)泰康胶囊、新复方党参片及二者联合应用对低氧免疫损伤小鼠的调节作用模拟海拔8000m低氧暴露6d后,模型组小鼠外周血CD3+、CD4+,脾脏CD4+、CD8+细胞数均显著降低(P<0.01),说明模型组小鼠细胞免疫功能紊乱。新复方党参片、泰康胶囊、二者联合应用均能显著增加低氧免疫损伤小鼠外周血CD3+、CD4+、脾脏CD4+的细胞水平(P<0.01, P<0.05),对脾脏CD8+细胞水平没有显著影响。泰康胶囊及其与新复方党参片联合应用均能进一步降低胸腺CD4+CD8+,进一步增加CD4+CD8-的细胞水平(P<0.01),未见对CD4-CD8+细胞水平的影响;新复方党参片对低氧免疫损伤小鼠胸腺没有显著性影响。说明新复方党参片、泰康胶囊及二者联合应用均可显著提高低氧免疫损伤小鼠外周血、脾脏淋巴细胞数,但二者作用机制不同。综上所述,本研究结论如下:1、模拟海拔8000m低氧暴露6d,机体发生免疫损伤的特点是:机体特异性细胞免疫功能降低同时伴有脾脏肿大和胸腺萎缩。外周血T淋巴细胞数(CD3+)逐渐降低,其中小鼠以辅助性T淋巴细胞(CD4+)下降为主,同时伴有CD4+/CD8+比值下降;大鼠是CD4+和CD8+细胞数同时下降。脾脏主要是CD4+和CD8+细胞同时下降导致的CD3+细胞数的显著下降,CD4+/CD8+不发生显著变化。中枢免疫器官胸腺,起初代偿性的减少不成熟的双阳性细胞来增加成熟的单阳性细胞的含量,但随着低氧暴露时间延长,胸腺产生成熟淋巴细胞的功能失代偿。2、模拟海拔8000m低氧暴露6d,外周发挥免疫作用的淋巴细胞数减少可能与低氧暴露早期淋巴细胞凋亡率和坏死率增加和肺脏淋巴细胞分布增多有关。3、新复方党参片、泰康胶囊及其二者联合应用均可显著增加低氧免疫损伤小鼠外周血、脾脏T淋巴细胞数,说明二者作为低氧免疫损伤干预措施,具有一定发展前景。