转座子存在于真核生物基因组内,被称为垃圾基因。迄今为止,三种反转录转座子依旧具有活性:L1,Alu和SVA元件。L1反转录转座子是跳跃基因,在基因组中具有大量拷贝,它占人类基因组17%,占斑马鱼基因组的10%以上。它们利用“复制-粘贴”机制通过RNA中间体在整个基因组中繁殖,这一过程称为逆转录。L1在种系和胚胎发生过程中具有活性,它们在体细胞中主要是表观遗传机制抑制的。具有逆转录活性的L1长约6kb,包含5’非翻译区(UTR),两个开放阅读框(ORF1和ORF2),以及以poly(A)尾结束的3’UTR。5’UTR含有CpG岛和内部启动子,ORF1和ORF2都是L1转座所必需的,ORF1的功能仍然模糊不清,但已显示其具有核酸伴侣活性,参与L1核糖核蛋白颗粒(RNP)的形成,ORF2在哺乳动物中高度保守,并含有内切核酸酶和逆转录酶结构域;3’UTR在物种之间显示非常少的保守性。逆转座导致基因组改变,多数时候给基因组带来负面影响,比如:改变基因组结构,影响基因表达,改变基因调控方式等,因此宿主基因会通过启动子区域甲基化,或者小RNA干扰等机制来抑制转座。但是越来越多的研究表明转座元件与基因组是相互有益的,逆转座子的转座能够导致新基因的生成,这对于物种的多样性和物种进化具有积极意义。当面对环境因素刺激时,基因组进行自身进化诱导转座子转座,使生物对环境变化做出适应性改变。鱼类作为变温动物,水温变化在很大程度上影响其生理及行为。南极大陆经历了长期降温,水温常年处于0℃以下,南极鱼Notothenioids是南极圈内的优势种,其如何在极端寒冷下生存,并且抵抗严峻的环境是一个重要的问题。有研究发现低温下南极鱼基因组L1相对于南极圈外的鱼的基因组,发生了大量扩增。这些结果也表明在寒冷环境下,南极鱼进化出了抵御寒冷的方式,产生了新的基因,而这些新的基因的产生可能与LINE的扩增有关。环境对脊椎动物生理学和进化的影响的大部分知识来源于鱼类研究,这些鱼类与人类具有大多数生理机制。斑马鱼(Danio rerio)由于体型纤细,成体长3~4 cm,对水质要求不高。孵出后约4个月达到性成熟,成熟鱼每隔几天可产卵一次,卵子体外受精,体外发育,胚胎发育速度快,胚体透明、子代多、遗传背景清楚,容易进行实验操作,易于在实验室内繁殖饲养,与人类基因87%相似,因而作为一种模式生物应用于生物学中。本实验借助斑马鱼作为实验材料,研究L1在鱼类低温适应方面的功能。为了研究L1在长期低温环境下大量扩增是否与寒冷适应具有关系。将细胞培养在18℃,发现细胞在18℃低温环境中处理5 d细胞明显生长停滞,而后二十天左右逐渐恢复生长状态,尽管相比28℃依旧缓慢。并且在之前研究中发现LINE甲基化水平在低温环境中有所改变,18℃低温处理ZF4细胞5 d L1甲基化水平升高而18℃低温处理ZF4细胞30 d甲基化水平降低。生物体会通过甲基化水平来调节L1表达量,据此猜测低温是否会通过甲基化影响5’UTR区域启动子活性进而影响L1的表达扩增,这种调节可能是生物体应对外界低温环境压力的方式之一,并且发现生活在缺氧条件下的shizothoracine鱼类,基因组中LINE的表达量也有显著增加。这些结论说明极端环境下,生物体基因组调节LINE扩增,增加基因组多样性,应对外界环境的变化。本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行了不同时间长度的低温处理(18℃5 d和18℃30 d),同时对斑马鱼成鱼也进行了不同时间长度的低温处理(10℃3 h、6 h、1 d、3 d、5 d),使用RT-qPCR检验了L1的mRNA水平;并克隆了斑马鱼L1基因启动子区,利用Luciferase双荧光报告系统,在ZF4细胞中验证5’UTR在细胞中的生物活性并在低温处理(18℃3 d)监测5’UTR活性。结果显示:(1)在细胞中,短期低温处理L1 mRNA水平有所降低,而在长期低温处理中,L1的mRNA水平显著升高。(2)在成鱼中,短期低温处理下L1 mRNA水平降低,长期低温处理L1 mRNA显著升高。(3)在ZF4细胞中发现5’UTR具有生物活性。(4)发现在低温处理(18℃3 d)报告基因信号减弱,间接表明L1 5’UTR区域启动子活性减弱。推测L1对生物体适应外界低温环境压力有积极作用,生物体在寒冷环境下L1逆转座水平升高,猜测是生物体对环境压力产生适应性进化。综上所述,本实验通过对斑马鱼细胞以及斑马鱼成鱼不同时间段的低温处理,研究L1的mRNA水平,以及低温下5’UTR区域活性的改变为我们更好地了解寒冷适应机制奠定了基础。