论文部分内容阅读
目的：观察黄菟益肾方对C-BSA特发性膜性肾病(IMN)大鼠的干预效果；检测自噬及凋亡相关蛋白mTOR、P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ及Caspase3的表达，从mTOR/P70S6K通路探讨该方保护肾脏的作用机制，为临床应用黄菟益肾方提供实验依据。
方法：SPF级雄性SD大鼠110只，随机留取15只作为空白对照组(NG)，其余95只采用尾静脉注射C-BSA制备IMN大鼠模型，造模成功后随机分为6组：模型组(MG)；中药大剂量组(ZHG)；中药中剂量组(ZMG)；中药小剂量组(ZLG)；雷帕霉素组(RG)；贝那普利组(BG)。灌胃治疗2周(各组分别处死5只大鼠)及4周末(处死剩余大鼠)，分别检测24h尿蛋白定量(24hUTP)，血清生化指标(ALT、AST、ALB、TP、TC、TG)，肾组织透射电镜，肾脏病理光镜(HE、Masson、PASM)，免疫组化检测Nephrin蛋白表达。治疗4周末另用Real-TimePCR检测大鼠肾组织mTOR、P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3mRNA的表达，Westernblot检测大鼠肾组织P-mTOR、P-P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3蛋白的表达。
结果：
1.黄菟益肾方对IMN大鼠一般状态的影响
实验过程中NG大鼠一般状态良好。MG大鼠精神不振，毛色暗黄，纳差少饮，尿量减少，大便溏稀，头面胖大及四肢肿胀，偶见少量腹水，并随实验时间延长病情加重。治疗2周及4周末，黄菟益肾方大中小剂量组大鼠一般状态均明显好转，尤以ZMG组疗效显著。
2.黄菟益肾方对IMN大鼠24hUTP的影响
与NG组相比，MG大鼠24hUTP显著升高(P＜0.01)，提示模型复制成功。治疗2周末，各治疗组与MG组相比，大鼠24hUTP降低无统计学差异(P＞0.05)；治疗4周末，各治疗组大鼠与MG组相比24hUTP均不同程度降低(P＜0.01)，尤以ZMG降低显著；各治疗组间差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。同组间相比(除ZHG组外)，治疗4周显著优于治疗2周，且ZMG疗效显著优于同时间点各治疗组。
3.黄菟益肾方对IMN大鼠低蛋白血症的影响
与NG组相比，MG大鼠TP、ALB含量均明显降低(P＜0.01)，出现低蛋白血症。治疗2周末，各治疗组与MG组相比，大鼠TP、ALB含量升高均无统计学差异(P＞0.05)。治疗4周末，各治疗组与MG组相比，大鼠TP、ALB含量均显著升高(P＜0.01)，其中ZMG组升高最为显著，ZLG组次之；各治疗组间差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。同组间相比(除ZHG组外)，治疗4周显著优于治疗2周，且以ZMG大鼠TP、ALB含量升高最为显著(P＜0.01)。
4.黄菟益肾方对IMN大鼠高脂血症的影响
与NG相比，MG大鼠TG、TC含量均显著升高(P＜0.01)，出现高脂血症。治疗2周末，与MG相比，各治疗组大鼠TG、TC含量不同程度升高或降低，均无统计学差异(P＞0.05)。治疗4周末，与MG相比，除RG组TG、TC含量明显升高(P＜0.05)；其余各治疗组大鼠TG、TC含量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG降低显著。与治疗2周同组间相比，RG大鼠TG、TC含量显著升高(P＜0.01)；ZMG、ZLG明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG降低显著。
5.黄菟益肾方对IMN大鼠肾组织病理的影响
光镜下可见，NG大鼠肾小球结构正常；MG大鼠2周末可见嗜复红蛋白沉积于上皮细胞下，毛细血管袢扩张、空泡、僵硬，GBM弥漫沉积絮状物，钉突形成；4周末MG大鼠病理表现进行性加重。治疗2周及4周末，与同时期MG组相比，各治疗组大鼠肾脏病理均不同程度明显改善，尤以ZMG改善显著，优于其他治疗组；治疗4周末与治疗2周末同组间相比，各治疗组大鼠肾脏病理改变减轻，尤以ZMG组改善显著。
6.黄菟益肾方对IMN大鼠肾组织超微结构的影响
透射电镜下可见NG大鼠肾小球基底膜均匀无增厚，无电子致密物沉积，足细胞足突整齐、间隙均等、无足突融合或膨大。治疗2周及4周末，同时期MG大鼠基底膜弥漫性增厚，上皮下大量电子致密物沉积，足细胞足突广泛融合，足突端膨大，间隙不等均进行性加重；同时期各治疗组与MG组相比均有不同程度改善，肾小球基底膜增厚、足突融合及膨大均减轻，上皮下电子致密物沉积减少；ZMG显著优于同期各治疗组。治疗4周末与治疗2周同组间相比，各治疗组大鼠肾小球基底膜增厚、足突融合均明显改善，尤以ZMG组改善显著。
7.黄菟益肾方对IMN大鼠足细胞Nephrin蛋白表达的影响
免疫组化结果显示，与NG相比，MG大鼠Nephrin蛋白表达明显降低(P＜0.01)。治疗2周末，与MG相比，各治疗组大鼠Nephrin蛋白表达升高无统计学差异(P＞0.05)。治疗4周末，与MG相比，各治疗组大鼠Nephrin表达明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG、RG升高显著。与治疗2周同组间相比(除ZHG组外)，各治疗组Nephrin表达均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG、RG升高显著。
8.黄菟益肾方对IMN大鼠肾组织mTOR、P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3mRNA及P-mTOR、P-P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3蛋白表达的影响
治疗4周末，Real-TimePCR和Westernblot结果显示，与NG相比，MG大鼠mTOR、P70S6K、Caspase3mRNA及P-mTOR、P-P70S6K、Caspase3蛋白表达量明显升高，ULK1、LC3ⅡmRNA及蛋白表达显著降低(P＜0.01)；与MG相比，各治疗组大鼠上述mRNA及蛋白表达均不同程度升高或降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中自噬相关蛋白及mRNA尤以ZMG、ZLG、RG组改善显著；而Caspase3mRNA及蛋白表达则以ZMG组改善最佳。
结论：
1.特发性膜性肾病大鼠足细胞自噬能力下降，足细胞凋亡增加。
2.黄菟益肾方可有效改善IMN大鼠一般状态，降低24h尿蛋白定量，升高血浆白蛋白，纠正脂代谢紊乱，疗效明显。
3.黄菟益肾方可改善IMN大鼠肾脏病理损害，上调足细胞Nephrin的表达，改善足细胞损伤，减缓IMN病程进展。
4.黄菟益肾方可通过抑制mTOR/P70S6K通路激活自噬，改善足细胞凋亡，从而发挥对IMN大鼠的肾脏保护作用。
5.黄菟益肾方大中小剂量均可有效改善IMN大鼠症状及病理改变，尤以中剂量最佳。
方法：SPF级雄性SD大鼠110只，随机留取15只作为空白对照组(NG)，其余95只采用尾静脉注射C-BSA制备IMN大鼠模型，造模成功后随机分为6组：模型组(MG)；中药大剂量组(ZHG)；中药中剂量组(ZMG)；中药小剂量组(ZLG)；雷帕霉素组(RG)；贝那普利组(BG)。灌胃治疗2周(各组分别处死5只大鼠)及4周末(处死剩余大鼠)，分别检测24h尿蛋白定量(24hUTP)，血清生化指标(ALT、AST、ALB、TP、TC、TG)，肾组织透射电镜，肾脏病理光镜(HE、Masson、PASM)，免疫组化检测Nephrin蛋白表达。治疗4周末另用Real-TimePCR检测大鼠肾组织mTOR、P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3mRNA的表达，Westernblot检测大鼠肾组织P-mTOR、P-P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3蛋白的表达。
结果：
1.黄菟益肾方对IMN大鼠一般状态的影响
实验过程中NG大鼠一般状态良好。MG大鼠精神不振，毛色暗黄，纳差少饮，尿量减少，大便溏稀，头面胖大及四肢肿胀，偶见少量腹水，并随实验时间延长病情加重。治疗2周及4周末，黄菟益肾方大中小剂量组大鼠一般状态均明显好转，尤以ZMG组疗效显著。
2.黄菟益肾方对IMN大鼠24hUTP的影响
与NG组相比，MG大鼠24hUTP显著升高(P＜0.01)，提示模型复制成功。治疗2周末，各治疗组与MG组相比，大鼠24hUTP降低无统计学差异(P＞0.05)；治疗4周末，各治疗组大鼠与MG组相比24hUTP均不同程度降低(P＜0.01)，尤以ZMG降低显著；各治疗组间差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。同组间相比(除ZHG组外)，治疗4周显著优于治疗2周，且ZMG疗效显著优于同时间点各治疗组。
3.黄菟益肾方对IMN大鼠低蛋白血症的影响
与NG组相比，MG大鼠TP、ALB含量均明显降低(P＜0.01)，出现低蛋白血症。治疗2周末，各治疗组与MG组相比，大鼠TP、ALB含量升高均无统计学差异(P＞0.05)。治疗4周末，各治疗组与MG组相比，大鼠TP、ALB含量均显著升高(P＜0.01)，其中ZMG组升高最为显著，ZLG组次之；各治疗组间差异显著(P＜0.05或P＜0.01)。同组间相比(除ZHG组外)，治疗4周显著优于治疗2周，且以ZMG大鼠TP、ALB含量升高最为显著(P＜0.01)。
4.黄菟益肾方对IMN大鼠高脂血症的影响
与NG相比，MG大鼠TG、TC含量均显著升高(P＜0.01)，出现高脂血症。治疗2周末，与MG相比，各治疗组大鼠TG、TC含量不同程度升高或降低，均无统计学差异(P＞0.05)。治疗4周末，与MG相比，除RG组TG、TC含量明显升高(P＜0.05)；其余各治疗组大鼠TG、TC含量均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG降低显著。与治疗2周同组间相比，RG大鼠TG、TC含量显著升高(P＜0.01)；ZMG、ZLG明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG降低显著。
5.黄菟益肾方对IMN大鼠肾组织病理的影响
光镜下可见，NG大鼠肾小球结构正常；MG大鼠2周末可见嗜复红蛋白沉积于上皮细胞下，毛细血管袢扩张、空泡、僵硬，GBM弥漫沉积絮状物，钉突形成；4周末MG大鼠病理表现进行性加重。治疗2周及4周末，与同时期MG组相比，各治疗组大鼠肾脏病理均不同程度明显改善，尤以ZMG改善显著，优于其他治疗组；治疗4周末与治疗2周末同组间相比，各治疗组大鼠肾脏病理改变减轻，尤以ZMG组改善显著。
6.黄菟益肾方对IMN大鼠肾组织超微结构的影响
透射电镜下可见NG大鼠肾小球基底膜均匀无增厚，无电子致密物沉积，足细胞足突整齐、间隙均等、无足突融合或膨大。治疗2周及4周末，同时期MG大鼠基底膜弥漫性增厚，上皮下大量电子致密物沉积，足细胞足突广泛融合，足突端膨大，间隙不等均进行性加重；同时期各治疗组与MG组相比均有不同程度改善，肾小球基底膜增厚、足突融合及膨大均减轻，上皮下电子致密物沉积减少；ZMG显著优于同期各治疗组。治疗4周末与治疗2周同组间相比，各治疗组大鼠肾小球基底膜增厚、足突融合均明显改善，尤以ZMG组改善显著。
7.黄菟益肾方对IMN大鼠足细胞Nephrin蛋白表达的影响
免疫组化结果显示，与NG相比，MG大鼠Nephrin蛋白表达明显降低(P＜0.01)。治疗2周末，与MG相比，各治疗组大鼠Nephrin蛋白表达升高无统计学差异(P＞0.05)。治疗4周末，与MG相比，各治疗组大鼠Nephrin表达明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG、RG升高显著。与治疗2周同组间相比(除ZHG组外)，各治疗组Nephrin表达均明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，尤以ZMG、RG升高显著。
8.黄菟益肾方对IMN大鼠肾组织mTOR、P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3mRNA及P-mTOR、P-P70S6K、ULK1、LC3Ⅱ、Caspase3蛋白表达的影响
治疗4周末，Real-TimePCR和Westernblot结果显示，与NG相比，MG大鼠mTOR、P70S6K、Caspase3mRNA及P-mTOR、P-P70S6K、Caspase3蛋白表达量明显升高，ULK1、LC3ⅡmRNA及蛋白表达显著降低(P＜0.01)；与MG相比，各治疗组大鼠上述mRNA及蛋白表达均不同程度升高或降低(P＜0.05或P＜0.01)，其中自噬相关蛋白及mRNA尤以ZMG、ZLG、RG组改善显著；而Caspase3mRNA及蛋白表达则以ZMG组改善最佳。
结论：
1.特发性膜性肾病大鼠足细胞自噬能力下降，足细胞凋亡增加。
2.黄菟益肾方可有效改善IMN大鼠一般状态，降低24h尿蛋白定量，升高血浆白蛋白，纠正脂代谢紊乱，疗效明显。
3.黄菟益肾方可改善IMN大鼠肾脏病理损害，上调足细胞Nephrin的表达，改善足细胞损伤，减缓IMN病程进展。
4.黄菟益肾方可通过抑制mTOR/P70S6K通路激活自噬，改善足细胞凋亡，从而发挥对IMN大鼠的肾脏保护作用。
5.黄菟益肾方大中小剂量均可有效改善IMN大鼠症状及病理改变，尤以中剂量最佳。