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WRKY转录因子通过整合来自细胞质免疫信号并在细胞核内转录调节抗病相关基因的表达在植物抗病反应中起重要的作用,但细胞质的信号传递到WRKY蛋白的机制仍然不是很清楚。本实验室研究发现CaWRKY17作为应答高温高湿和青枯菌的正调节因子,通过与CaWRKY40互作在辣椒抗青枯病原菌侵染以及高温高湿胁迫中起协同作用。本研究通过酵母双杂交分离获得2个与CaWRKY17的依赖于钙离子的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)型蛋白激酶基因CaCDPK17和CaCDPK29,分析了这两个蛋白编码基因的表达及其在辣椒应答高温高湿和青枯菌侵染中的作用,验证了它们与CaWRKY17的互作及其在辣椒应答高温高湿和青枯菌侵染中的作用,主要结果如下:(1)实时荧光定量PCR研究发现,CaCDPK17在高温高湿、青枯菌侵染或外源植物激素ABA处理下被诱导转录表达;CaCDPK29既能被高温高湿、青枯菌接种诱导转录表达,也能被外源植物激素MeJA和SA处理所激活,但其转录表达却受到外源植物激素ABA处理的抑制。通过在本氏烟草叶片上进行35s:CaCDPK17-GFP 和 35S:CaCDPK29-GFP 的瞬间表达,发现CaCDPK17-GFP和CaCDPK29-GFP均定位在本氏烟草细胞的细胞膜上。通过在辣椒植株上进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)分析,发现CaDPK17沉默使辣椒植株对青枯菌侵染的抗性增强,但对高温高湿胁迫的耐受性有一定程度的削弱。CaCDPK29的沉默使辣椒植株对青枯菌侵染的抗性和对高温高湿胁迫的耐受性均严重削弱。(2)通过酵母双杂交实验筛选、BiFC和co-IP等实验技术验证了 CaWRKY17与CaCDPK17以及与CaCDPK29的互作,且互作主要发生在细胞膜上。CaCDPK17和Ca WRKY17共同瞬间超表达可显著降低Ca WRKY17激活的过敏反应介导的细胞死亡和相关抗病标记基因的表达,但却可增强了 Ca WRKY17对耐高温相关基因表达的上调能力;CaCDPK29与Ca WRKY17的共同瞬间超表达则进一步提高了 CaWRKY17对高温高湿耐受性或青枯菌接种的抗性。鉴于我们另一个课题中研究发现在高温高湿或青枯菌接种的条件下CaWRKY17可与CaWRKY40在细胞核内互作,表明CaWRKY17可进入细胞核。有关CaCDPK29或CaWRKY17对Ca WRKY17进入细胞核的影响还有待进一步研究。(3)进一步通过 ChIP-qPCR 分析 CaWRKY40 和 CaWRKY17对启动子中含典型W-box的CaCDPK17和CaCDPK29的可能直接转录调控作用。结果发现,CaWRKY17无法结合CaCDPK17或CaCDPK29的启动子,但CaWRKY40却可以结合两个CDPK基因的启动子,且在CaWRKY40和Ca WRKY17同时过表达的情况下CaWRKY40结合CaCDPK29启动子的能力增强。相应地,real-time RT-PCR分析发现,CaWRKY1 7瞬间表达对CaCDPK17和CaCDPK29的转录表达没有明显影响,而Ca WRKY40的瞬间表达则对CaCDPK29的转录表达具有明显的促进作用。综上所述,CaCDPK17、CaCDPK29可能通过与CaWRKY17的互作在将病原菌信号传递到细胞核并调节CaWRKY17的功能上起重要的作用,该结果有助于进一步解析辣椒应答青枯菌的防御反应分子机制。