犬GM-CSF对犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫增强作用的研究

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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由T细胞、B细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等分泌产生的,是重要的造血生长因子和免疫调节因子,能促进前体细胞的存活、增殖、分化,促进粒细胞和单核/巨噬细胞分化与形成集落。GM-CSF具有招募树突状细胞(DC)、单核细胞等抗原递呈细胞到抗原注射位点的功能,同时在促进树突状细胞前体细胞分化中起着关键作用。因此GM-CSF被认为是一个新一代高效的分子免疫佐剂。犬细小病毒基因组编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因作为生物佐剂其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用。首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1载体上,分别构建该基因的两个真核表达载体:不融合标签的表达载体pcDNA-cGM-CSF和与Myc-His融合的表达载体pcDNA-cGM-CSF/MH。用pcDNA-cGM-CSF/MH载体转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western-blot试验证明GM-CSF能够在真核细胞中进行分泌表达。然后用本室构建的犬细小病毒VP2基因表达载体与pcDNA-cGMCSF共同免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照)。免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体滴度。用MTT法检测小鼠免疫后35d淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。结果表明,本实验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达。免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平显著高于VP2基因单免疫组(P<0.01)。共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和干扰素γ的表达水平均比单免疫组(P<0.05)高。综上,本试验构建的GM-CSF表达载体可显著提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平。
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