论文部分内容阅读
背景简介:paxillin蛋白是局部黏着斑(focal adhesions,FAs)结构蛋白之一。其一端与细胞骨架相连,另一端与FAs及整合素相关蛋白相连,因而可能是细胞内信号转导途径中的关键节点。然而,由于缺乏活细胞内检测paxillin蛋白上应力变化的探针工具,paxillin蛋白内的应力变化和相关信号转导机制仍不清楚。方法:本文基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术设计并制备出活细胞内paxillin蛋白的应力检测探针DSMP。探针一端为LD12基序,能和细胞骨架蛋白连接;另一端为LIM1234,可实现FAs的靶定;中间镶嵌一对荧光蛋白ECFP/Ypet,蛋白对之间为蜘蛛丝来源的分子弹簧序列(GPGGA)×8。将探针转染入肿瘤细胞U-2 OS中,首先对探针DSMP进行稳定性、特异性和线性度的验证;然后采用经典的平行平板流动腔系统对细胞加载剪切应力,同时用药物干扰细胞膜和细胞骨架,以及改变基质硬度;最后用荧光显微镜获取FRET图像,结合Matlab编程图像分析获得FRET效率随时间的变化。按照应力作用方向将细胞分为上游和下游,分析上下游FAs内paxillin蛋白受力差异。结果:经功能验证实验证明,DSMP探针可以准确地嵌入FAs内,其FRET效率可以反映paxillin蛋白内发生的应力变化,并具有良好的稳定性、特异性和线性度;剪切应力作用下,paxillin蛋白受力增大,且上下游有显著性差异,即存在受力的极性变化;增大细胞膜流动性,这种极性消失;反之,降低细胞膜流动性,上下游仍存在差异,但极性与仅加载应力的极性趋势相反;破坏微丝结构会使极性消失,而破坏微管结构后paxillin蛋白的极性受力依旧存在。结论:本课题成功构建了能反映细胞FAs上paxillin蛋白应力变化的DSMP探针;剪切应力下细胞FAs内paxillin蛋白受力依赖于细胞骨架的完整性,而其受力的极性状态与细胞膜的流动性和微丝系统直接相关。本文证明了细胞内存在细胞膜-细胞骨架-FAs的应力传递途径,其应力传递的上下游差异可能是细胞发生极性功能变化的直接原因,同时也为肿瘤细胞迁移的力生物学研究提供了一种细胞内应力检测的可视化工具。