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[目 的]1.探究糖尿病鼠内皮祖细胞外泌体（即db/db EPC-EXOs）与非糖尿病鼠内皮祖细胞外泌体（即db/+EPC-EXOs）之间的功能差异。2.探寻 db/db EPC-EXOs 与 db/+EPC-EXOs 之间的差异 miRNA。3.研究差异miRNA对C166细胞功能的影响。[方 法]1.通过Ficoll密度梯度离心法分离内皮祖细胞,并对EPCs形态、表面标志物（CD34、CD133、VEGFR2、CD45）、内皮祖细胞在基质胶表面有成血管的能力、EPCs有摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力来共同鉴定内皮祖细胞。2.通过聚合物沉淀法获得内皮祖细胞源外泌体,外泌体将进行Western blotting鉴定表面标志物（CD9、CD63）、透射电子显微镜观察及NTA粒径分析共同鉴定外泌体。3.通过PKH26标记外泌体进行外泌体内化实验。实验分为5组,空白对照组、db/+EPC-EXOs-50 组、db/+EPC-EXOs-100 组、db/db EPC-EXOs-50 组、db/db EPC-EXOs-100组,并进行CCK-8实验、成管实验及划痕实验研究db/db EPC-EXOs与db/+EPC-EXOs对C166小鼠血管内皮细胞增殖、成管、迁移能力的作用及差异。4.通过进行第二代测序技术,探寻db/db EPC-EXOs与db/+EPC-EXOs之间的差异miRNA,并通过Q-PCR技术进行验证。5.通过荧光显微镜判断miRNA的转染效率。实验分为8组,mimic-NC组、inhibitor-NC 组、miR-29b-3p mimic 组、miR-29b-3p inhibitor 组、miR-714 mimic组、miR-714 inhibitor 组、miR-709 mimic 组、miR-709 inhibitor 组;并进行CCK-8实验、成管实验及划痕实验研究所选差异miRNA（miR-29b-3p,miR-714、miR-709）的过表达及抑制对C166小鼠血管内皮细胞增殖、成管、迁移能力的影响。[结 果]1.成功提取小鼠骨髓中的内皮祖细胞。EPCs形态呈现典型的“铺路石”样的特征;EPCs 表面标志物为 CD34（+）、CD133（+）、VEGFR2（+）、CD45（-）,其中db/+EPCs纯度为91.033%,db/db纯度为85.533%;内皮祖细胞在基质胶表面观察到有成血管的能力;并且观察到内皮祖细胞有摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力。2.成功分离出内皮祖细胞源外泌体。Western blotting结果可见EPC-EXOs可表达外泌体经典表面标志物CD9、CD63;在透射电子显微镜下EPC-EXOs呈“碟状”;NTA粒径分析结果显示,EPC-EXOs的直径主要集中在100-200nm之间。3.荧光显微镜下观察到EPC-EXOs被C166细胞摄取。外泌体增殖实验结果显示,在 db/db 小鼠 EPC-EXOs 中,db/db EPC-EXOs-100 组增殖能力低于 db/db EPC-EXOs-50 组（P＜0.01）和空白对照组（P＜0.01）;在 db/+小鼠 EPC-EXOs中,db/+EPC-EXOs-100 组增殖效果优于 db/+EPC-EXOs-50 组（P＜0.01）和空白对照组（P＜0.01）;当对比db/+小鼠与db/db小鼠EPC-EXOs的增殖能力时,在相同浓度下db/db EPC-EXOs增殖能力低于db/+EPC-EXOs。外泌体成管实验结果综合显示db/+EPC-EXOs成管能力高于空白对照组;db/db EPC-EXOs成管能力弱于空白对照组;并且在相同浓度下db/db EPC-EXOs成管能力低于db/+EPC-EXOs。外泌体划痕实验结果显示db/+EPC-EXOs-100组细胞迁移愈合能力与任何组对比都强,db/+EPC-EXOs-50组细胞迁移愈合能力强于空白对照组（P＜0.0001）,db/dbEPC-EXOs-100组细胞迁移愈合能力弱于空白对照组（P＜0.01）及 db/db EPC-EXOs-50 组（P＜0.0001）。4.通过测序比较db/db EPC-EXOs组与db/+EPC-EXOs组,得到2组共同表达但存在含量差异的32个miRNA,在|log2FC丨≥2且q值＜0.005条件下筛选出11个miRNA;经过Q-PCR验证后,得到在db/db EPC-EXOs中高表达的 miRNA:miR-3473b,miR-3473e,miR-146a-5p,miR-714,miR-29b-3p,miR-223-3p,miR-125b-5p,miR-92a-3p,miR-151-3p;及在 db/db EPC-EXOs 中低表达的 miRNA:miR-709,miR-574-5p。5.荧光显微镜下观察到转染效果良好。考虑到miRNA的新颖性、相关性,我们选择了在 db/db EPC-EXOs 中高表达的 miR-29b-3p,miR-714 及在 db/db EPC-EXOs中低表达的miR-709进行后续的功能实验。miRNA增殖实验结果显示,miR-29b-3p mimic 组、miR-714 mimic 组及 miR-709 inhibitor 组有抑制C166细胞增殖的能力;miR-29b-3p inhibitor组、miR-714 inhibitor组及miR-709 mimic组有促进C166细胞增殖的能力。miRNA成管实验结果综合显示miR-29b-3p mimic 组、miR-714 mimic 组及 miR-709 inhibitor 组有抑制 C166细胞成管的能力;miR-29b-3p inhibitor组、miR-714 inhibitor组有促进成管的能力。miRNA划痕实验结果显示miR-29b-3p mimic组、miR-714 mimic组及miR-709 inhibitor组有抑制划痕愈合的作用;而miR-29b-3p inhibitor组、miR-714 inhibitor组及miR-709 mimic组促进划痕愈合的效果并不明显。[结 论]1.糖尿病鼠EPC-EXOs与非糖尿病鼠EPC-EXOs之间的确存在功能差异,即db/db EPC-EXOs 功能弱于 db/+EPC-EXOs,并且 db/db EPC-EXOs 对 C166细胞增殖、成管、迁移能力有抑制作用,而db/+EPC-EXOs对C166细胞增殖、成管、迁移能力有促进作用。2.db/db EPC-EXOs 与 db/+EPC-EXOs 中有多个表达差异的 miRNA。3.选取miR-29b-3p、miR-714及miR-709进行体外功能实验,结果提示在糖尿病小鼠内皮祖细胞外泌体中高表达的miR-29b-3p、miR-714的模拟物,低表达的miR-709的抑制剂对C166细胞增殖、成管、划痕愈合能力有抑制作用。考虑是导致db/db EPC-EXOs表现出抑制能力的原因之一。