【摘 要】
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第一部分副溶血弧菌重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用目的:副溶血弧菌是广泛分布在沿海地区的致病菌,可引起食物中毒,进而导致胃肠炎甚至脓毒症。本研究旨在发挥重组酶介导的等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）技术现场快速检测细菌的能力,成功开发一种快速灵敏的RAA检出技术,用于检测粪便和鱼类标本中的副溶血弧菌,为副溶血弧菌的防控提供技术支持。方法:1.根
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第一部分副溶血弧菌重组酶介导等温扩增检测方法的建立及应用目的:副溶血弧菌是广泛分布在沿海地区的致病菌,可引起食物中毒,进而导致胃肠炎甚至脓毒症。本研究旨在发挥重组酶介导的等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）技术现场快速检测细菌的能力,成功开发一种快速灵敏的RAA检出技术,用于检测粪便和鱼类标本中的副溶血弧菌,为副溶血弧菌的防控提供技术支持。方法:1.根据RAA的引物探针设计原则,针对副溶血弧菌的高保守序列Tox R基因设计一条探针和四条引物。2.用含有副溶血弧菌Tox R基因的重组质粒筛选最佳引物探针组合。3.使用质粒和标准菌株评价RAA检测该菌的灵敏度,并通过检测其他弧菌和非弧菌验证特异性。4.采用模拟粪便标本分析RAA对于粪便标本的最低检测限,通过增菌培养分析增菌后RAA技术可以检出该菌的最短时间。5.用100份粪便标本和12份鱼类标本验证RAA技术在临床标本和海产品中的适用性。以上所有实验均采用实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）进行平行检测。结果:副溶血弧菌RAA方法可以检测出10~1copies/μL的质粒和10-3ng/μL的标准菌株,在模拟粪便样品的对比分析中,RAA技术可以直接检测7×10~3CFU/m L的副溶血弧菌。将接种浓度最低的副溶血弧菌（0.1CFU/m L）的粪便样本富集4小时后,RAA技术即可得到阳性结果。使用粪便样本和鱼类样本的RAA分析的敏感性和特异性与real-time PCR的敏感性和特异性100%一致。结论:副溶血弧菌RAA法快速、准确、操作简单,其在粪便标本和海产品标本中的副溶血弧菌的成功检测,说明了该法是检测副溶血弧菌甚至是食源性病原体的理想筛查方法,具有在临床以及食品加工行业的潜在应用价值。第二部分重组酶介导等温扩增结合重组人MBL蛋白包被的磁珠富集技术的建立及其在血液标本低载量EB病毒检测中的应用目的:本部分研究通过将RAA技术与使用包被有重组人甘露聚糖结合凝集素（recombinant human mannan-binding lectin,rh MBL,M1蛋白）的磁珠富集步骤相结合,建立了一种检测病原微生物的新方法（MB-RAA）,进一步提升RAA的灵敏度,并通过检测低病毒载量的血液标本中的EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）来评估该方法的临床应用价值。方法:1.制备M1蛋白-protein A磁珠复合体（M1磁珠）,用于实现EBV从血液中的分离富集。2.提取核酸后,进行RAA反应扩增EBV-DNA。3.共使用389份血样本,评估新开发检测方法的敏感性和适用性,并与M1磁珠富集后的商业定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q PCR）、富集前的q PCR和RAA法进行比较。结果:本研究成功建立了MB-RAA方法,并成功应用于血液标本中EBV的检测。富集后EBV阳性率RAA法由15.94%提高到17.74%（P＜0.05）,q PCR法由7.20%提高到15.17%（P＜0.05）。富集后检测出的病毒载量增加了1.13至23.19倍（P＜0.05）。结论:我们的数据表明,MB-RAA方法是检测血液样本中低载量病毒的有前景的工具,这将有助于发现早期病毒感染患者并给予其及时的治疗。
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