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【研究目的】肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAFs)是口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中最重要的细胞成分之一。CAFs可以通过细胞旁分泌等方式影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。近年来随着纳米医学的发展,以CAFs细胞作为治疗靶点设计纳米材料成为了恶性肿瘤新的治疗策略。在本文中,我们着重于探索不同粒径金纳米颗粒(Golden nanoparticles,GNPs)对CAFs生物学功能的影响,及后续对肿瘤细胞的影响,为GNPs应用于OSCC治疗奠定理论基础。【研究方法】1、通过柠檬酸盐和DMSA还原法合成不同粒径的GNPs并通过透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-Vis)、动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)、Zeta电位对合成的GNPs的物理化学性质进行表征;2、收集临床OSCC患者标本,通过组织贴壁法分离出CAFs及正常成纤维细胞(Normal fibroblasts,NFs);并通过免疫荧光和q RT-PCR对提取出的CAFs进行鉴定;随后利用光镜,TEM,电感耦合等离子体质谱仪(inductively coupled plasma massspectrometry,ICP-MS)等方法定性与定量检测15μg/m L GNPs培养6h后CAFs细胞对不同粒径GNPs摄取的情况(包括细胞内定位,吞噬质量,吞噬数量);随后利用CCK-8细胞增殖实验不同粒径GNPs处理24h后对CAFs细胞增殖情况的影响;接着利用鬼笔环肽染色显示CAFs细胞骨架,观察CAFs细胞骨架结构的改变情况;利用Transwell小室迁移实验观察不同粒径GNPs处理后CAFs迁移能力的变化情况;利用ELISA法检测不同粒径GNPs处理后CAFs上清分泌因子HGF,VEGF,IL-6,IL-8,TGF-β1,PDGF-αα的改变情况;利用免疫印迹试验(Western Blot,WB)、免疫荧光、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)检测不同粒径GNPs处理后CAFs的α-SMA、vimentin、FSP-1、N-cadherin基因及蛋白层面表达的改变情况3、利用CCK-8细胞增殖实验和Transwell小室迁移实验,观察不同粒径GNPs处理后的CAFs上清所制成的条件培养基对OSCC细胞(SCC9,R-cab)增殖和迁移能力的影响;接着通过构建裸鼠OSCC模型,利用免疫组化等手段观察不同粒径GNPs对CAFs细胞及肿瘤细胞的功能的影响,并同时观察不同粒径金纳米对裸鼠的毒性作用。【实验结果】1、我们成功通过柠檬酸盐还原法和DMSA法成功合成了分散性良好的3-nm、15-nm、30-nm、50-nm、80-nm不同粒径的球形GNPs;表征结果显示,随着GNPs粒径的增加,其紫外光谱将会发生红移;2、TEM和ICP-MS结果显示GNPs被吞噬后,主要分布于细胞内囊泡中;其中CAFs吞噬50-nm GNPs的质量最多,而通过公式转换后,CAFs吞噬3-nm GNPs的数量最多;细胞增殖和迁移实验等结果显示不同粒径的GNPs对来自OSCC的CAFs增殖能力无明显影响,对细胞骨架结构没有明显破坏作用;不同粒径的GNPs处理后,CAFs迁移能力发生改变,其中3-nm可以明显抑制CAFs的迁移(p<0.001);q RT-PCR结果显示,经过15μg/m L的3-nm GNPs处理后的CAFs活性相关蛋白N-cadherin,Vimentin,α-SMA以及FSP-1的表达明显下降(P<0.05);Elisa检测结果显示,不同粒径的GNPs会不同程度的影响CAFs的分泌功能,GNPs处理后的CAFs上清中HGF,VEGF,IL-6,IL-8,TGF-β1,PDGF-αα均有所下降。其中,3-nm的GNPs处理后的CAFs分泌指标被显著抑制(P<0.05);3、体外CCK-8增殖实验和Transwell细胞迁移实验发现,经不同粒径GNPs处理后,CAFs促肿瘤增殖迁移的能力发生了不同程度的改变,其中3-nm可以明显逆转CAFs对肿瘤细胞的促增殖(P<0.001)和促迁移能力(P<0.001);动物体内实验发现CAFs可以促进肿瘤的增殖,而瘤周注射GNPs后,CAFs促肿瘤增殖情况得到了逆转,免疫组化结果进一步证明了经3-nm,15-nm GNPs处理后,CAFs的活性相关蛋白N-cadherin,Vimentin,α-SMA,FSP-1的表达发生了明显的降低,CAFs分泌的促肿瘤增殖相关因子HGF,VEGF,IL-6,IL-8,TGF-β1以及PDGF-αα的水平发生了下调;裸鼠体重变化趋势和主要脏器的病理分析结果提示了不同粒径的GNPs均对裸鼠无明显的毒性作用。【结论】GNPs对口腔磷癌CAFs功能的改变具有粒径依赖性,其中3-nm GNPs可以明显抑制CAFs的活性状态,降低其促肿瘤相关的细胞因子的分泌,并进一步起到抗肿瘤生长的作用。