目的:随着麻醉理念的更新及麻醉技术的进步,麻醉已不局限于提供良好的手术条件、保障患者术中安全,全麻药物神经毒性这一议题引起社会广泛关注和讨论。由于生育政策的调整,我国孕妇数量剧增,同时高龄产妇的构成比上升,胎儿发育不良及致畸率明显增高。得益于胎儿宫内治疗技术的迅猛发展,部分胎儿疾病能够在出生前得到干预和治疗,而孕妇妊娠期间行非产科手术麻醉的病例越来越多。目前研究发现,各类全身麻醉药物对脑发育期中枢神经系统均具有潜在神经毒性作用,因此迫切需要采取相应的措施来有效减轻全身麻醉药物所致的脑发育期神经毒性。临床研究表明孕妇怀孕期间常规的运动锻炼有益于子代脑发育。多项啮齿类动物实验也证实生理状态下妊娠期跑台训练、游泳、自由转轮等多项母体运动有利于提高子代认知功能。其可能的机制涉及多个层面:促进神经发生、促进神经因子表达、促进长时程增强、提高抗氧化能力等。然而目前,母体运动对妊娠期麻醉暴露所致子代神经毒性的影响及机制尚不清楚。表观遗传修饰是指DNA序列不发生变化的情况下,基因表达发生可遗传改变,是机体普遍存在的基因调控方式之一。表观遗传修饰在神经科学领域,特别是脑发育和神经退行性病变中发挥重要作用。在脑发育过程中,基因组容易受到外部环境、药物等因素的刺激,导致其在大脑皮层、海马等部位发生表观遗传修饰(如DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA等)异常,影响学习记忆相关基因的表达,干扰神经突触可塑性和认知功能。组蛋白乙酰化是组蛋白修饰的重要方式之一,通过松散染色质内部结构促进学习记忆相关基因的转录表达,进而增强突触可塑性和学习记忆功能。组蛋白乙酰化通过组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HATs)催化完成。HATs可以通过促进基因转录表达对突触可塑性发挥正调控作用。目前发现,p300为参与学习记忆功能调节的HATs,并且已有研究证实p300在海马依赖性空间学习记忆中起着关键作用。多种组蛋白乙酰化位点中,H3K9、H3K14及H3K27位点的乙酰化水平与突触可塑性及学习记忆有着密切联系。在多种参与调控认知功能的学习记忆相关基因中,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因的转录在以往研究中已经被证实接受组蛋白乙酰化修饰的调控。酪氨酸蛋白激酶受体B(tropomyosin receptor kinase B,Trk B)为BDNF的高亲和力受体,结合后通过激活下游蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)促进神经元树突棘的发育。综上,本课题首先明确孕中期大鼠单次与多次七氟醚吸入麻醉对子代脑发育的影响,初步探究七氟醚诱导脑发育期神经毒性的可能机制是否与组蛋白乙酰化修饰异常及BDNF表达下调有关;其次,探究母体跑台训练对孕中期大鼠多次七氟醚吸入麻醉所致子代认知损伤的改善作用及与BDNF/Trk B信号通路的关系;最后,探究组蛋白乙酰转移酶p300介导的组蛋白乙酰化修饰在母体运动改善孕中期大鼠七氟醚吸入所致子代认知损伤中的作用及机制。研究方法:1、实验动物选择SD大鼠,进行合笼,孕鼠于G14天接受一次3%七氟醚麻醉2 h或分别在G13、G14和G15天连续三天每天接受一次3%七氟醚麻醉2 h。麻醉结束后6 h、24 h及子代出生后0天(P0)采用Western Blot检测Ace-H3K9/14/27和BDNF表达变化,出生后25天(P25)开始进行旷场试验、平衡木试验、悬吊试验、Morris水迷宫测试等检测子代大鼠神经行为学变化,行为学测试结束后尼氏染色观察海马CA1区神经元密度变化,高尔基染色观察神经元树突棘密度变化,Western Blot检测突触相关蛋白PSD95和GAP43表达变化。2、采用孕中期大鼠多次七氟醚吸入麻醉模型。孕鼠在整个孕期接受跑台训练,跑台训练的同时注射Trk B受体阻断剂ANA-12,其余组注射空白溶剂。子代大鼠P0天采用Western Blot检测Ace-H3K14/27和BDNF表达变化;P28天Morris水迷宫测试检测子代大鼠空间学习记忆功能;行为学测试结束后尼氏染色观察海马CA1区神经元密度变化,高尔基染色观察神经元树突棘密度变化,Western Blot检测突触相关蛋白PSD95和GAP43表达变化。3、采用孕中期大鼠多次七氟醚吸入麻醉模型。孕鼠在整个孕期接受跑台训练,跑台训练的同时注射p300抑制剂Garcinol,其余组注射空白溶剂。子代大鼠P0天采用p300/Neu N、Ace-H3K14/Neu N、Ace-H3K27/Neu N免疫荧光双染分别检测子代大鼠海马CA1区神经元中p300、Ace-H3K14、Ace-H3K27表达变化;采用Western Blot检测p300、Ace-H3K14/27、BDNF/Trk B/Akt信号通路变化;P28天Morris水迷宫测试检测子代大鼠空间学习记忆功能;行为学测试结束后尼氏染色观察海马CA1区神经元密度,高尔基染色观察神经元树突棘密度,Western Blot检测突触相关蛋白PSD95和GAP43表达变化。结果:1、孕中期大鼠多次七氟醚吸入麻醉降低子代脑组织或海马Ace-H3K14/27和BDNF表达,子代大鼠空间学习记忆能力受损,伴随海马CA1区神经元密度降低,树突棘密度降低,突触相关蛋白表达降低。而单次七氟醚吸入麻醉后上述指标未见明显改变。2、母体跑台训练能够改善多次七氟醚吸入麻醉所致子代海马BDNF表达下降,激活Trk B/Akt信号通路,改善子代大鼠空间学习记忆功能,海马CA1区神经元密度增加,树突棘密度增加,突触相关蛋白表达升高。母体跑台训练的同时注射Trk B受体阻断剂ANA-12,ANA-12阻断了母体运动的脑保护作用。3、母体跑台训练能够改善七氟醚所致子代海马p300及Ace-H3K14/27表达下降,激活BDNF/Trk B/Akt信号通路,改善子代大鼠空间学习记忆功能,海马CA1区神经元密度增加,树突棘密度增加,突触相关蛋白表达升高。母体跑台训练的同时注射p300抑制剂Garcinol,Garcinol阻断了母体运动的脑保护作用。结论:1、孕中期大鼠多次七氟醚吸入麻醉能够通过降低子代脑组织或海马组蛋白乙酰化修饰和BDNF表达,导致子代大鼠空间学习记忆能力受损,伴随海马CA1区神经元丢失及树突棘密度下降。单次七氟醚吸入麻醉后上述指标未见明显改变。2、母体运动通过激活BDNF/Trk B/Akt信号通路,改善子代大鼠空间学习记忆能力和神经元发育障碍。3、母体运动通过促进组蛋白乙酰转移酶p300表达,促进组蛋白乙酰化修饰,激活BDNF/Trk B/Akt信号通路,改善子代大鼠空间学习记忆能力和神经元发育障碍。