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研究目的TBC1D3癌基因最初是在人前列腺癌细胞中发现的,该基因在多种肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和骨髓增生异常综合征等组织中均高表达,高表达的TBC1D3能使小鼠NIH 3T3成纤维细胞恶性转化为肿瘤细胞,把恶性转化细胞注入裸鼠体内,可导致肿瘤形成,但其机制尚不十分清楚,特别是TBC1D3对乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响及其机制还有待阐明。我们前期的转录组高通量测序结果提示,癌基因TBC1D3高表达可上调人MCF-7乳腺癌细胞中HSPA6表达,而HSPA6属于热休克蛋白70（HSP70）家族,该家族成员在众多恶性肿瘤组织中高表达,能促进细胞增殖并在肿瘤的化疗耐药中至关重要。因此,本实验主要探讨癌基因TBC1D3对人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响以及HSPA6在其中的作用。研究方法1.为了探讨TBC1D3在调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用,我们以未转染细胞为空白对照,用Lipofectamine（?）3000方法将Flag空载体和Flag-TBC1D3质粒分别转染人MCF-7非三阴性乳腺癌细胞和BT549三阴性乳腺癌细胞,24 h后,用CCK8方法检测转染后不同时间点（如0h、12 h、24 h、36 h、48 h）、抗肿瘤药物表阿霉素（Epirubicin,EPI）处理细胞后不同时间点（如0h、12 h、24 h、36h、48 h）、或不同浓度（如0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L）EPI处理细胞24 h后存活的细胞,分析癌基因TBC1D3高表达对人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响。2.为了研究癌基因TBC1D3在调节人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性中的作用机制,我们用Lipofectamine（?）3000方法将Flag空载体和Flag-TBC1D3分别转染MCF-7细胞或BT549细胞,然后提取细胞总RNA进行实时定量RT-PCR,检测HSPA6 mRNA水平,或提取细胞裂解物进行Western blot,检测HSPA6蛋白水平,以验证我们前期的转录组高通量测序结果:TBC1D3高表达上调MCF-7细胞中HSPA6表达。3.为了明确HSPA6在癌基因TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用,我们以Flag空载体为对照,用Lipofectamine（?）3000方法将Flag-TBC1D3分别转染 MCF-7 和 BT549 细胞,用 DMSO、HSPA6 功能抑制剂 Apoptozole（AZ）、EPI 单独,或AZ和EPI两者合用处理细胞,24 h后,用CCK8方法检测存活的细胞,分析HSPA6功能抑制对癌基因TBC1D3调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的影响。4.为初步探讨HSPA6功能的抑制使TBC1D3促进乳腺癌细胞增殖和降低细胞EPI化疗敏感性的作用丧失机制,我们以Flag空载体为对照,用Lipofectamine（?）3000方法将Flag-TBC1D3分别转染人乳腺癌MCF-7和BT549细胞,并用DMSO或15 μmol/L AZ处理细胞,24 h后,用Western blot方法检测细胞内Flag-TBC1D3蛋白水平,分析HSPA6功能抑制对人乳腺癌细胞内TBC1D3蛋白稳定性的影响。研究结果1.TBC1D3癌基因促进人乳腺癌细胞增殖和降低乳腺癌细胞对表阿霉素化疗的敏感性:在探讨TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的研究中,CCK8细胞增殖实验显示,与未转染细胞和转染Flag空载体细胞相比较,转染Flag-TBC1D3的人MCF-7和BT549乳腺癌细胞增殖显著增加。用不同浓度表阿霉素（Epirubicin,EPI）进行的CCK8细胞毒性实验显示,随着EPI浓度的增高,未转染组、转染Flag空载体组和转染Flag-TBC1D3组的存活细胞数均逐渐减少,除所用的最低浓度2.5 mmol/L和最高浓度80 mmol/L外,在 5、10、20、40 和 60 mmol/L 等其它浓度,Flag-TBC1D3 转染使 MCF-7细胞和BT549细胞对EPI的敏感性显著降低,MCF-7和BT549细胞存活分别较Flag空载体组和未转染组增加最多可达约60%和约30%。用20 mmol/L和40 mmol/L的EPI处理细胞不同时间的CCK8细胞毒性实验显示,EPI处理12 h后,Flag-TBC1D3虽能使MCF-7细胞和BT549细胞对较高浓度（40mmol/L）EPI的敏感性均显著降低,但仅能显著降低BT549细胞对低浓度（20mmol/L）EPI的敏感性;处理24h和36h后,Flag-TBC1D3使两种细胞无论对较高还是较低浓度EPI的敏感性均显著降低;处理48 h后,Flag-TBC1D3虽能显著降低两种细胞对较低浓度（20 mmol/L）EPI的敏感性,但仅能使MCF-7细胞对较高浓度（40mmol/L）EPI的敏感性显著降低;EPI处理60h后,转染Flag空载体、转染Flag-TBC1D3或未转染的MCF-7和BT549细胞对较低和较高浓度EPI的敏感性均无明显差异。这些结果表明,TBC1D3癌基因能促进人乳腺癌细胞增殖和降低乳腺癌细胞对EPI化疗的敏感性,并且,TBC1D3降低乳腺癌细胞对EPI的敏感性呈浓度、时间和细胞系种类的依赖性。2.癌基因TBC1D3促进人乳腺癌细胞HSPA6 mRNA和蛋白表达:在探讨TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的机制研究中,前期转录组高通量测序实验显示,在所检测到的37364个基因中TBC1D3显著上调43个基因,显著下调56个基因。在TBC1D3上调差异倍数最高的前10个基因中,HSPA6与细胞增殖密切相关,并且,其所属的HSP70家族在肿瘤化疗敏感性中至关重要。实时定量RT-PCR验证实验显示,与Flag空载体组相比较,TBC1D3能促进MCF-7细胞HSPA6 mRNA显著上调,高达约8倍;Western blot验证实验显示,TBC1D3高表达能使MCF-7细胞和BT549细胞中HSPA6蛋白水平均较Flag空载体组高约3倍。这些结果提示,TBC1D3高表达能促进人乳腺癌细胞HSPA6转录表达。3.HSPA6功能抑制对癌基因TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的影响:在探讨HSPA6是否参与癌基因TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的研究中,用HSPA6功能抑制剂Apoptozole（AZ,15 μmol/L）和DMSO对照进行的CCK8细胞增殖实验显示,与DMSO对照相比较,AZ能抑制MCF-7细胞和BT549细胞存活;相反,Flag-TBC1D3能促进这些细胞增殖,但用AZ抑制HSPA6功能后,Flag-TBC1D3基本丧失了对细胞增殖的促进作用。用EPI、AZ和DMSO对照进行的CCK8细胞毒性实验显示,HSPA6功能抑制剂AZ和抗肿瘤药EPI的单独处理均能显著抑制MCF-7细胞和BT549细胞存活,并且AZ和EPI合用能显著增加这些细胞对EPI化疗药物的敏感性;相反,Flag-TBC1D3能降低MCF-7和BT-549细胞对EPI单独处理的敏感性。Flag-TBC1D3不影响MCF-7细胞对AZ单独处理的敏感性,但与AZ合用能使Flag-TBC1D3降低MCF-7细胞对EPI敏感性的作用基本丧失。与MCF-7细胞不同,Flag-TBC1D3能明显降低BT-549细胞对AZ单独处理的敏感性,但是,与AZ合用未能使Flag-TBC1D3降低BT-549细胞对EPI敏感性的作用丧失。4.HSPA6功能抑制不影响人乳腺癌细胞内TBC1D3蛋白的稳定性:在初步探讨HSPA6调节TBC1D3作用的机制研究中,用AZ和DMSO对照进行的Westernblot实验显示,用AZ抑制HSPA6功能,对MCF-7细胞和BT549细胞内HSPA6自身的蛋白水平和Flag-TBC1D3蛋白的稳定性均没有明显影响。这些结果提示,HSPA6并不是通过增加TBC1D3蛋白稳定性调节其作用。结论1.癌基因TBC1D3高表达可促进人乳腺癌细胞增殖和降低细胞对表阿霉素的敏感性;2.癌基因TBC1D3高表达促进人乳腺癌细胞HSPA6转录表达;3.HSPA6功能的抑制可能调节TBC1D3对人乳腺癌细胞增殖和EPI化疗敏感性的影响;4.HSPA6功能抑制不影响人乳腺癌细胞内TBC1D3蛋白的稳定性。