论文部分内容阅读
目的 已有研究miR-142在多种癌症、病毒感染、炎症和免疫耐受中发挥着重要作用,但在肝癌中的作用尚不清楚,表达失调的原因不明。本文拟研究miR-142-3p在肝癌组织和细胞的表达差异,与不良预后的关系,表观遗传分析表达失调的原因,探寻miR-142-3p与靶基因TGFβ1的关系及调控肝癌发生发展的机制。方法1、检测50对肝癌组织及其相应癌旁组织,qRT-PCR检测miR-142-3p在肝癌组织和癌旁组织中的表达。统计分析了 mir-142-3p和TGF-β1的表达与临床数据之间的相关性。生物信息学预测了 miR-142-3p的靶基因,双荧光素酶验证miR-142-3p与靶基因TGF-β1之间的相互结合作用关系。2、构建过表达的miR-142-3p 载体,分别转染肝癌细胞株 SMMC7721、HepG2,(1)qRT-PCR及WB检测过表达miR-142-3p后TGF-β1的表达变化,证明二者之间存在相关性;(2)CCK-8法测定细胞增殖,绘制细胞增殖曲线;(3)流式细胞仪检测细胞增殖活力变化;(4)transwell检测细胞侵袭迁移能力;(5)WB检测EMT相关蛋白的变化;(6)HUVES管状血管形成试验检测对肿瘤血管形成的影响;(7)Elisa检测肝癌细胞分泌TGF-β、VEGF细胞因子变化。3、甲基化检测方法检测miR-142-3p启动子甲基化程度;加入甲基化抑制剂5-Aza,(1)CCK-8法测定细胞增殖,绘制细胞增殖曲线;(2)流式细胞仪+Brdu增殖试验检测肝癌细胞增殖活力变化;(3)transwell检测细胞侵袭迁移能力;(4)WB检测EMT相关蛋白的变化;(5)管样血管形成试验检测对肿瘤血管形成的影响;(6)Elisa检测肝癌细胞分泌TGFβ、VEGF细胞因子变化。结果1、miR-142-3p表达降低与肝癌临床预后不良相关qRT-PCR结果表明,miR-142-3p在HCC组织中的表达明显低于相应的癌旁组织。肝癌细胞HepG 2和SMMC 7721中miR-142-3p的表达水平均低于正常人肝细胞HL-7702,与临床病人组织测定结果一致,另外,miR-142-3p低表达的患者具有更晚的TNM分期和更低的组织分化,并且更可能转移。2、TGF-β1是miR-142-3p在肝癌中的直接靶点结果发现TGF-β1在肝癌标本和细胞系HepG2,SMMC7721中显著升高,与临床标本miR-142-3p水平呈负相关。此外,过表达miR-142-3p抑制了 HepG 2和SMMC7721细胞的TGF-β1的表达,而miR-142-3p抑制剂能恢复此过程中的TGF-β1 mRNA和蛋白水平。双荧光素酶结果表明,miR-142-3p mimic能显著降低野生型TGF-β1-3’UTR的荧光素酶活性,但对突变型无明显影响。3、miR-142-3p靶向抑制TGF-β1而抑制肝癌增殖、侵袭等恶性生物学行为过表达miR-142-3p使肝癌细胞活力降低,抑制迁移侵袭和分泌VEGF、TGF-β,上调E-cadherin表达,降低N-cadherin表达即抑制EMT,抑制HUVEs管状血管形成,但这些结果均可被过表达TGF-β1挽回。4、miR-142-3p启动子区高度甲基化导致其缺失表达亚硫酸氢盐测序分析结果表明,HCC组织中的miR-142-3p甲基化程度明显高于正常组织。在HepG 2和SMMC 7721细胞中也证实了这一相似的结果。此外,甲基化抑制剂5-Aza可抑制miR-142-3p的甲基化,以恢复miR-142-3p在HepG 2和SMMC 7721细胞中的表达,伴随着TGF-β1表达降低。5、甲基化抑制剂5-Aza可以回复miR-142-3p表达及抗肿瘤作用5-Aza能恢复miR-142-3p表达,降低细胞增殖活力,抑制EMT、迁移侵袭能力,减弱了 miR-142-3p抑制剂的促管样血管形成能力,但这些结果均能被miR-142-3p抑制剂逆转。结论miR-142-3p作为肿瘤抑制因子在HCC中表达失调,其低表达可能与肝癌不良预后相关,而低表达原因在于其启动子区高甲基化。TGF-β1是miR-142-3p的靶基因并且miR-142-3p靶向抑制TGF-β1信号轴抑制肝癌的发生发展,包括增殖,迁移和侵袭,EMT,肿瘤血管形成,分泌细胞因子TGF-β和VEGF。有趣的是,甲基化抑制剂5-Aza可以恢复miR-142-3p的表达,以靶向抑制TGF-β1依赖的肿瘤增殖、迁移侵袭、EMT和前血管生成能力而清除肿瘤。