【摘 要】
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是专性细胞内寄生性原虫,其生活史的各阶段均有感染性。猫是弓形虫唯一终末宿主,可广泛寄生于人和其他恒温动物,对人类健康和畜牧业发展带来很大危害,是世界关注的公共卫生问题。根据宿主的免疫状态不同,所导致的弓形虫感染情况和临床结果也具有较大差异,常表现为隐形感染状态,严重者会因中枢神经系统和全身性的播散、损害而死亡。弓形虫具有嗜神经特性,
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2018YFD0501200）； 广东省重大科研项目（特色创新）（2017KTSCX018）； 广东省自然科学基金项目（2016A030313396）；
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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是专性细胞内寄生性原虫,其生活史的各阶段均有感染性。猫是弓形虫唯一终末宿主,可广泛寄生于人和其他恒温动物,对人类健康和畜牧业发展带来很大危害,是世界关注的公共卫生问题。根据宿主的免疫状态不同,所导致的弓形虫感染情况和临床结果也具有较大差异,常表现为隐形感染状态,严重者会因中枢神经系统和全身性的播散、损害而死亡。弓形虫具有嗜神经特性,可导致弓形虫脑炎以及其他脑部疾病,但其致病机制仍是当前研究的重点。在本实验室前期的研究中,我们选取了差异表达最为显著的脑神经发育调节蛋白（Drebrin,Dbn1）作为诱饵蛋白,调取了与之相互作用的6中弓形虫蛋白,其中包括外泌体蛋白α-微管蛋白（α-tubulin,TUBA1）。根据外泌体的结构及其易透过血脑屏障的特点,解析弓形虫脑病中外泌体与虫体入侵相互作用的机制,需要更深入的研究。为了研究TUBA1基因的生物学功能,本研究利用pGEX-6p-1原核表达载体,构建pGEX-6p-1-TUBA1重组质粒。使用TUBA1重组蛋白免疫小鼠,制备小鼠多克隆抗体。通过构建含有HA标签的TUBA1真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HA-TUBA1,并转染至神经瘤母细胞（N2a）内,通过透射电子显微镜和荧光显微镜观察自噬小体,并通过WB检测LC3Ⅰ/Ⅱ的表达变化。实验结果表明,成功构建了TUBA1的原核表达质粒和真核表达质粒,并制备了小鼠抗TUBA1多克隆抗体,并通过间接免疫荧光检测到TUBA1在弓形虫ME49株速殖子中的表达与分布。这为后续研究TUBA1的生物学功能及其在弓形虫致病中的作用提供了技术支持。真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HA-TUBA1转染至N2a细胞48 h后,N2a细胞皱缩、突触减少,并观察到特征性的自噬小体,自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表达上调,证明了Tg TUBA1蛋白促进了N2a细胞自噬的发生。
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